Inhibició p38mapk: un nou enfocament combinat per reduir la resistència al neuroblastoma sota tractament amb etoposides | mort i malaltia cel·lular

Inhibició p38mapk: un nou enfocament combinat per reduir la resistència al neuroblastoma sota tractament amb etoposides | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Resistència terapèutica contra el càncer
  • Càncer de SNC
  • Teràpia orientada molecularment

Resum

El neuroblastoma (NB) és el segon tumor pediàtric sòlid més comú i es caracteritza per heterogeneïtat clínica i biològica, i l'estadi IV de la malaltia representa el 50% de tots els casos. Tenint en compte l’èxit limitat del tractament de quimioteràpia actual, ha estat necessari trobar teràpies noves i efectives. En aquest context, el nostre enfocament consisteix a identificar i orientar les vies moleculars clau associades a la quimiresistència NB. Aquest estudi s'ha realitzat en tres línies cel·lulars de la fase IV i NB amb estatus diferents d'amplificació MYCN. Les cèl·lules estaven exposades a un agent de quimioteràpia estàndard, és a dir, etoposida, sola o en combinació amb determinats fàrmacs, que orienten les vies de senyalització intracel·lular. L’etoposida va provocar una reducció de la viabilitat cel·lular depenent de la concentració i, a dosis molt elevades, va contrarestar totalment la tumorigenicitat cel·lular i la formació de la neurosfera. A més, l’etoposida va activar la proteïna quinasa activada amb mitogen p38 (MAPK), AKT i la cinaasa N-terminal c-Jun. El pretractament amb SB203580, un inhibidor de p38MAPK, va sensibilitzar dramàticament les cèl·lules NB a l’etoposide, reduint fortament la dosi necessària per inhibir la tumorigenicitat i la formació de la neurosfera. És important destacar que el cotractament SB203580 – etoposida també va reduir la migració cel·lular i la invasió afectant la ciclooxigenasa-2, la molècula d’adhesió intercel·lular-1, el receptor de la quimiocina C-X – C i la metaloproteasa matricial-9. Col·lectivament, els nostres resultats suggereixen que la inhibició de p38MAPK, en combinació amb la quimioteràpia estàndard, podria representar una estratègia efectiva per contrarestar la resistència del NB en pacients en fase IV.

Principal

El neuroblastoma (NB) és el segon tumor maligne pediàtric més comú i es caracteritza per heterogeneïtat biològica i clínica. 1, 2 Si bé un NB de baix risc pot retrocedir o diferenciar-se espontàniament en un ganglioneuroblastoma benigne, el NB d’alt risc (estadi IV) dóna lloc a una difusió metastàtica 3 i només el 20% dels pacients sobreviuen 5 anys del diagnòstic malgrat la quimioteràpia agressiva. 4

L’estratificació terapèutica actual de pacients amb NB es basa en l’avaluació del risc segons combinacions d’edat, etapa del tumor, estat MYCN, estat de ploidy d’ADN i histopatologia. Aquesta heterogeneïtat biològica fa necessària la identificació de marcadors addicionals d’estratificació i pronòstic, així com de vies moleculars que es poden orientar en combinació amb la quimioteràpia estàndard. Tanmateix, l’eficàcia de la teràpia d’un únic agent està limitada per mecanismes de resistència que dificulten el seu èxit clínic. Un factor que contribueix a la malignitat de la NB és la presència d’una subpoblació de cèl·lules mare resistents a la quimio-ràdio a la massa del tumor. 5 Aquestes cèl·lules mare de tipus càncer (CSC) contribueixen tant a la progressió del càncer com a les metàstasis. A la NB, de fet, les neurosferes (BNS), els CSC d’origen neuronal, s’han trobat en exemplars de tumors primaris, així com en línies cel·lulars establertes. 6

A més, s'ha demostrat que els NB agressius resistents a la teràpia sovint sobreexpressen i secreten nivells elevats de factors de creixement i quimiocines, 7 que són capaços d'activar vies de senyalització del creixement, proporcionant així un microambient adequat per al desenvolupament del tumor. 8, 9

En aquest estudi, es van analitzar les principals vies de supervivència i mort provocades per l’etoposida, un compost quimioterapèutic d’ús comú, en dues línies cel·lulars amplificades per MYCN i una no amplificada. En particular, el nostre estudi es va centrar fortament en HTLA-230, una de les línies de cèl·lules NB amplificades per MYCN, aïllades de l’aspiració de medul·la òssia d’un pacient amb la malaltia de l’etapa IV. Aquestes cèl·lules són altament cancerígenes 11 i fenotípicament semblants a altres cèl·lules NB metastàtiques aïllades de medul·la òssia. 12

Els nostres resultats demostren que la resistència a l’etoposide de les cèl·lules NB es deu a la presència de NBSs i suggereixen que SB203580, un inhibidor específic de la proteïna quinasa activada amb mitogen (MAPK) p38, en combinació amb l’etoposida, pot ser eficaç per prevenir el creixement cel·lular, la invasió, migració, angiogènesi i generació de BNS, que són tots els factors responsables de la recaiguda i la progressió del NB.

Resultats

L’etoposida indueix una reducció dependent de la dosi de la viabilitat cel·lular i les dosis altes contraresten totalment la tumorigenicitat de les cèl·lules NB i la formació de NBSs

Les cèl·lules NB es van exposar durant 24 hores a concentracions creixents d’etoposide (0, 07-225 μ M). Com es mostra a la figura 1a, l’etoposide va induir una reducció de la viabilitat cel·lular depenent de la dosi, començant per una concentració de 10 μ M i aconseguint una disminució del 70% a 225 μ M. Com es mostra a la figura 1b (panell esquerre), les cèl·lules no tractades van poder formen colònies (68 colònies de> 50 cèl·lules). De la mateixa manera, les cèl·lules NB van exposar durant 24 h a 1, 25 μ M etoposide, una concentració que imita in vitro la dosi utilitzada en teràpia clínica, 13 colònies formades (44 colònies de> 50 cèl·lules). Per contra, les dosis més grans d’etoposida (de 10 a 225 μ M) van suprimir totalment la clonogenicitat d’aquestes cèl·lules.

Image

L’etoposide disminueix la viabilitat cel·lular i, a altes concentracions de fàrmacs, inhibeix el potencial tumorigen de les cèl·lules HTLA-230 NB i impedeix la formació de NBS. ( a ) La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant assajos de MTT en cèl·lules exposades a concentracions creixents d’etoposida (0, 07-225 μ M) durant 24 hores. Els histogrames resumeixen dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. * P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr). ( b ) Tauler esquerre, assaig clonogènic. Les cèl·lules HTLA-230 es van sembrar en plaques de sis pous i després es van incubar amb 1, 25, 10, 50, 100, 150 i 225 μ M etoposida, segons s’indica, durant 24 hores. Posteriorment, es van incubar les cèl·lules en un medi fresc sense el medicament durant 20 dies addicionals abans de tacar i comptar les colònies. Taula dreta, assaig de formació de colònies d'agar tou. Les cèl·lules HTLA-230 es van tractar amb 1, opos, 1, 25, 10, 50, 100, 150 i 225 μ M etoposida, tal com s’indica, durant 24 hores, es van rentar i refilar en un medi que conté agar. Al cap de 25 dies, es van tacar i contar colònies. ( c ) Tauler esquerre, formació de NBS. Després del tractament amb etoposida (1, 25–100 μ M), es van cultivar cèl·lules HTLA-230 en condicions de cultiu lliures de sèrum que contenien bFGF i EGF durant una setmana (primer pas). Ampliació original × 10. Tauler dret, gràfic. A cada passatge (un a la setmana), els NBS en cèl·lules no tractades (Ctr) i en 1, 25 μ M tractades amb etoposides es van comptar mitjançant anàlisi a un microscopi invertit. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. ( d ) Anàlisis RT-PCR de CD133 i Oct4 en cèl·lules monocapa no tractades i tractades amb etopàsids i en NBSs procedents de les mateixes cèl·lules monocapa. El senyal de gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH) és el control intern de càrrega. Els resultats són representatius de tres experiments independents amb resultats essencialment similars. L'histograma, que es mostra al tauler dret, resumeix dades quantitatives dels mitjans, normalitzades a l'expressió GAPDH ± SD de tres experiments independents. * P <0, 01 contra cèl·lules monocapa

Imatge a mida completa

Com que el creixement independent de l’ancoratge és útil en la detecció de colònies, no apreciades per un assaig clonogènic, es van cultivar 14 cèl·lules tractades durant 24 h amb etoposida en un àgar semisòlid. De la mateixa manera, com es mostra a la figura 1b (plafó dret), es van detectar colònies només en mostres no tractades (25 colònies de> 25 cèl·lules) i en mostres d’etoposides de 1, 25 μ M (16 colònies de> 25 cèl·lules).

Quan les cèl·lules es van plasmar per sobre de la densitat clonal (10 cèl·lules per μl ) i es van cultivar en condicions adequades, es van observar molts NBSs en una setmana a les cèl·lules no tractades i 1, 25 μ M tractades amb etoposides (figura 1c). Curiosament, la quantitat de NBS va augmentar amb el nombre de passatge (Figura 1c), però les dosis més grans d’etoposide (10–100 μ M) van impedir la formació de NBSs, ja durant la primera setmana (Figura 1c).

Com es mostra a la figura 1d, les cèl·lules monocapa no tractades i tractades amb etoposida van expressar CD133 i Oct4, marcadors de cèl·lules mare conegudes. 15 A més, a la NBSs, al vuitè pas, originats des del control o des de les cèl·lules tractades, CD133 va augmentar el doble, mentre que Oct4 va augmentar un 40 i un 85% en NBSs no tractats i tractats, respectivament (Figura 1d).

Atès que els efectes sobre la viabilitat cel·lular i la clonogenicitat, induïts per 100 μ M etoposide, eren comparables als induïts per les dosis més altes, les posteriors anàlisis es van realitzar fins a 100 μM .

A les 24 hores de tractament de cèl·lules amb etoposide (10–100 μ M) va induir un augment de la dosi apoptòtica depenent de la dosi i es va observar un efecte necròtic a 50 i 100 μ M etoposide.

L’etoposida va produir un augment dependent de la dosi de les cèl·lules positives amb diclorofluoresceïna (DCF) que es van multiplicar per cinc vegades a 100 μ M i es va induir γ- H2AX, un marcador de ruptures de doble cadena d’ADN en cèl·lules tractades amb etoposida (dades no mostrades) .

L’etoposide activa p38MAPK, AKT i JNK

Tal com es mostra a la figura 2a, l’etoposide de 24 hores va augmentar la proteïna cinasa C (PKC) δ i va reduir els nivells de PKC α . Al analitzar les vies moleculars aigües avall del PKC, l'etoposide va induir una activació de p38MAPK depenent de la dosi, ja a 1, 25 μ M (Figura 2b, quadre esquerre). A més, es va activar la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) del 60 i 30%, a 1, 25 i 10 μ M, respectivament, però no es va observar cap efecte a les altres concentracions (figura 2b, quadre dret). A més, l'etoposide va augmentar l'activitat de Akt (fosfo-Thr-Akt / Akt) en un 70% en cèl·lules tractades amb la dosi d'1, 25 μ M i en un 50 i 35% (fosfo-Ser-Akt / Akt), respectivament, en cèl·lules. exposats a 50 i 100 μ M (Figura 2b, plafó inferior).

Image

Etoposide activa p38MAPK, Akt i JNK. ( a ) Nivells proteics de PKC δ i α a les cèl·lules tractades amb etoposida (1, 25–100 μ M). Els immunoblots que es mostren són representatius de tres experiments independents. β- L’actina és el control de càrrega interna. ( b ) Activació de p38MAPK, JNK i Akt. Els histogrames resumeixen dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05 i ** P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr). Les dades s’expressen com una proporció dels nivells de proteïnes fosforilades amb els nivells d’altres no fosforilades, els valors dels quals s’han normalitzat prèviament en contra de la β- actina

Imatge a mida completa

El tractament cotractament SB203580 / etoposide disminueix la viabilitat cel·lular, redueix la clonogenicitat i inhibeix la formació de SNB

Com que totes les molècules de senyalització analitzades ja s’activaven a 1, 25 μ M etoposida, es van investigar els efectes d’inhibidors enzimàtics específics a aquesta concentració d’etoposida. Tal com es mostra a la figura 3a (plafó esquerre), es va observar una reducció de la viabilitat de les cèl·lules quan les cèl·lules tractades amb etoposidi van ser exposades prèviament a LY290042 (fosfatidilinositol 3-cinasa (inhibidor de PI-3-cinasa) / Akt; disminució del 15%), a SB203580 (inhibidor de p38MAPK; disminució del 17%) i SP600125 (inhibidor de JNK; disminució del 30%). Tal com es mostra a la figura 3a (plafó dret), mentre que el pretractament amb PD98059 (inhibidor de MEK) va augmentar la capacitat de les cèl·lules NB de formar colònies en presència d’etoposida, sorprenentment, el pretractament amb SB203580 va reduir notablement la tumorigenicitat de les cèl·lules tractades amb etoposides. (Disminució del 60%).

Image

Efectes del cotractament SB203580 (SB) sobre la viabilitat cel·lular, la clonogenicitat i la formació de NBSs. ( a ) Viabilitat de la cel·la del tauler esquerre. Les cèl·lules es van pre-tractar durant 1 h amb els diferents inhibidors (0, 1 μ M clorur de quelerina (Chele), 500 nM LY2940042 (LY), 50 μ M PD98059 (PD), 10 μ M SB203580 o 4 μ M SP600125 (SP)) i després exposat a 1, 25 μ M etoposide durant 24 hores addicionals. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. * P <0, 05 vers les cèl·lules tractades amb etoposidi i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. Panell dret, assaig clonogènic. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. °iami P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. ( b ) Corba de creixement dels BNS. A cada passatge (un a la setmana), els NBS originats per etopòsids i cèl·lules pre-tractades dels inhibidors es van comptabilitzar mitjançant anàlisi a un microscopi invertit. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05 i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. ( c ) Tauler esquerre, activació de p38MAPK en cèl·lules de monocapa no tractades i en NBSs. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05 vers les cèl·lules monocapa no tractades i ** P <0, 01 contra les cèl·lules monocapa. Les dades s’expressen com una proporció dels nivells de proteïnes fosforilades a les proteïnes no fosforilades, els valors dels quals s’han normalitzat prèviament amb els nivells relatius de gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH). Panell dret, anàlisi immunoblot de MKP-1 en cèl·lules monocapa no tractades i en NBSs. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents

Imatge a mida completa

El tractament amb els inhibidors que afectaven la viabilitat cel·lular i la tumorigenicitat no va alterar per si mateix el nombre de SNB (dades no mostrades). Tal com es mostra a la figura 3b, l’etoposide no va modificar el nombre de BNS, ni tan sols en presència de pretractament amb LY290042 o SP600125 (primer pas). No obstant això, quan les cèl·lules foren prèviament tractades amb SB203580 i després exposades a etoposida, la formació de NBSs estava totalment absent, fins i tot des del primer pas (figura 3b).

A més, l’augment progressiu de NBS observats en cèl·lules no tractades, etoposides i cotreades va ser depenent dels passatges i va durar un període de 5 setmanes (figura 3b). Després de 6 setmanes, els cotractaments no van canviar el nombre de BNS (figura 3b).

En els NBS provinents de cèl·lules no tractades i tractades amb etoposida, p38MAPK es va activar 18 vegades en comparació amb les cèl·lules monocapa (figura 3c, tauler esquerre), mentre que l'expressió de la fosfatasa MAPK (MKP-1), inhibidor de p38MAPK, no va canviar. (Figura 3c, quadre dret).

SB203580 / etoposide o SP600125 / etoposides cotractaments inhibeixen la formació d'estructures similars

La capacitat de les cèl·lules NB de formar una xarxa de tubs no va ser modificada per etoposida o LY290042 després del tractament de 24 hores (Figura 4a). En canvi, SB203580 i SP600125 van reduir el nombre de branques a la xarxa de tubs en un 55% pel que fa a cèl·lules no tractades (Figura 4a, gràfic).

Image

SB203580 (SB) o SP600125 (SP) inhibeixen la formació d’estructures similars a la capil·lació i el cotractament SB203580 redueix la migració i la invasió de cèl·lules tractades amb etoposides. ( a ) Formació d’estructures de tipus capil·lar. Micrografies representatives de la xarxa completa de tubs formats per tractats (Ctr), tractats (amb etoposida, LY2940042, SB203580 o SP600125 sols) i cèl·lules cotreades (etoposides més inhibidors). El control negatiu s’obté mitjançant l’exposició cel·lular a sulforafan de 10 μ M. Ampliació original × 10. El gràfic informa del nombre de branques de la xarxa de tubs formades per cèl·lules en les condicions de tractament descrites anteriorment. Les dades quantitatives són el mitjà ± SD de tres experiments independents. °iami P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. ( b ) Anàlisi immunoblot de VEGF. L'histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents ° P <0, 05 vers cèl·lules no tractades (Ctr) i * P <0, 05 vers cèl·lules tractades amb etoposida. Les dades s’expressen com una proporció de VEGF a quantitats de gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH). ( c ) Test de migració. La migració cel·lular es va avaluar mitjançant els criteris de zero i Transwell. En el test zero, es va quantificar la taxa de migració mesurant la distància entre els límits de la cèl·lula migradora. En el test de Transwell, es va quantificar la migració comptant el nombre de cèl·lules, que es van desplaçar a la part inferior de la membrana després de 24 hores de tractament. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. * P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposida. ( d ) Test d’invasió. La invasió cel·lular es va quantificar comptant el nombre de cèl·lules, que es van desplaçar a la part inferior de la membrana recoberta després de 24 hores de tractament. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de sis camps per membrana de tres experiments independents. ° P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i * P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposid

Imatge a mida completa

Si bé l’associació de LY290042 amb l’etoposide no va alterar la formació de tubs, el cotractament amb SB203580 o SP600125 va disminuir el nombre de branques en un 90% respecte a les cèl·lules tractades amb etoposides (Figura 4a, gràfic). A més, els tubs formats per cèl·lules cotreades no tractades, tractades amb etoposides o LY290042, van persistir fins a 3 dies. Es van observar resultats similars en cèl·lules incubades en medi sense factor bàsic de creixement del fibroblast (bFGF) i factor de creixement endotelial vascular (VEGF) (dades no mostrades).

A més, SB203580, sol o en combinació amb etoposida, va reduir el VEGF en un 61 i un 69%, respectivament (Figura 4b). El SP600125 només va aconseguir augmentar la doble quantitat de VEGF, però la seva combinació amb etoposidi no va modificar l’expressió VEGF (figura 4b).

El tractament cotractament SB203580 / etoposide redueix la invasió i invasió de cèl·lules afectant la expressió de COX-2, ICAM-1, CXCR4 i la secreció de MMP-9.

La migració cel·lular no es va modificar per etoposidi (figura 4c) ni per LY290042 o SB203580 o SP600125 administrats sols (dades no mostrades). De la mateixa manera, els cotractaments d’etoposide amb LY290042 o SP600125 no van afectar la migració cel·lular (dades no mostrades). Val la pena assenyalar que el pretractament amb SB203580 va ser capaç de reduir la migració cel·lular en un 65% i un 50%, avaluats mitjançant els rascats i els assaigs de Transwell, respectivament (Figura 4c).

La invasió cel·lular es va reduir en un 33% després del tractament amb etoposides i es va inhibir en un 51% i un 80% després dels cotractaments LY290042 i SB203580, respectivament (Figura 4d). D'altra banda, el cotractament amb SP600125 no va canviar el nombre de cèl·lules invasores de membrana (figura 4d). El LY290042 o el SB203580 només van reduir la invasió cel·lular en un 34% i un 60%, respectivament, mentre que SP600125 per si no era efectiu (no es mostren dades).

Tenint en compte els efectes induïts pel cotractament SB203580 sobre la migració cel·lular i la invasió, es van investigar alguns marcadors moleculars, que es coneixen relacionats amb el fenotip invasor.

Tal com es mostra a la figura 5a, l’etoposide va induir un augment del 60% dels nivells de ciclooxigenasa (COX) -2, un efecte que va ser totalment inhibit pel pretractament amb SB203580. A més, el tractament amb SB203580 només va modificar els nivells de COX-2 en cèl·lules no tractades (Figura 5a).

Image

SB203580 (SB) redueix els nivells de COX-2, ICAM-1, CXCR4 i l'activitat de MMP9 en cèl·lules tractades amb etoposides. Anàlisis immunoblot de COX-2 ( a ), ICAM-1 ( b ) i CXCR4 ( c ). Els histogrames resumeixen dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. O ° P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr); ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. Les dades s’expressen en una proporció de quantitats de COX-2 o ICAM-1 o CXCR4 i quantitats de gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH). Activitat de MMP9 ( d ). Es mostra la imatge en blanc i negre invertida representativa de la zimografia de gelatina (panell esquerre). L’histograma (quadre dret) resumeix dades quantitatives dels mitjans ± SD de tres experiments independents. Les dades s’expressen com una proporció de pro-MMP9 a MMP9 actiu. * P <0, 05 vers cèl·lules tractades amb etoposida

Imatge a mida completa

La molècula d’adhesió intracel·lular-1 (ICAM-1) es va reduir un 25% després de l’etoposida i un 65% després de SB203580 només pel que fa a cèl·lules no tractades (figura 5b). D'altra banda, el cotractament SB203580 va reduir en un 40% els nivells d'ICAM-1 trobats després de l'etoposida (Figura 5b).

Com es mostra a la figura 5c, l’etoposide o SB203580 sols no van alterar els nivells del receptor de quimiocines C-X – C (CXCR4), mentre que el cotractament va ser capaç de disminuir el CXCR4 en un 60%.

Les anàlisis de l'activitat de la metaloproteasa matricial (MMP) van demostrar que la MMP-9 estava segregada per cèl·lules no tractades (figura 5d). A més, l’etoposide o SB203580 sols no van influir en la secreció de MMP-9 (figura 5d). No obstant això, els cotractaments amb etoposida / SB203580 van reduir l'alliberament de MMP-9 en un 33% (Figura 5d).

SB203580 / etoposide disminueix la viabilitat de les cèl·lules SK-N-SH i IMR-32, redueix la seva tumorigenicitat i inhibeix la formació de NBS només en cèl·lules IMR-32

Com es mostra a la Figura 6a, l’etoposide va induir una disminució de la viabilitat cel·lular de SK-N-SH (sense amplificació MYCN) i d’IMR-32 (amb amplificació MYCN) depenent de la dosi. Tot i això, mentre que la resposta de les cèl·lules IMR-32 al tractament amb etoposides era similar a la de les cèl·lules HTLA-230, les cèl·lules SK-N-SH eren més sensibles al fàrmac. De fet, l’etoposida de 24 hores, ja a 1, 25 μ M, va induir una reducció (del 30%) en la viabilitat cel·lular de SK-N-SH (Figura 6a).

Image

Efectes del cotractament SB203580 (SB) sobre la viabilitat, la clonogenicitat, l’expressió CC133 / Oct4 i l’activació p38MAPK en cèl·lules SK-N-SH i IMR-32. ( a ) Viabilitat cel·lular. Les cèl·lules SK-N-SH (panell esquerre) i IMR-32 (panell dret) van estar exposades a concentracions creixents d’etoposide (0, 07–225 μ M) durant 24 hores. Els histogrames resumeixen dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. * P <0, 05 i ** P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr). ( b ) Viabilitat cel·lular. SK-N-SH (panell esquerre) i IMR-32 (panell dret) es van tractar amb 1, 25 μ M etoposide / 10 μ M SB203580 sol o es va tractar prèviament durant 1 h amb 10 μ M SB203580 i es van exposar a 1, 25 μ M etoposida durant 24 hores addicionals. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. ° P <0, 05 versus cèl·lules no tractades (Ctr) i * P <0, 05 vers cèl·lules tractades amb etoposidi. ( c ) Test clonogènic. Les cel·les SK-N-SH (panell esquerre) i IMR-32 (panell dret) es van sembrar en plaques de sis pous i després es van incubar amb 1, 25 μ M etoposide / 10 μ M SB203580 sol o es va copejar amb SB203580 + etoposide durant 24 hores. Posteriorment, es van incubar les cèl·lules en un medi fresc sense el medicament durant 20 dies addicionals abans de tacar i comptar les colònies. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de cinc experiments independents. O ° P <0, 01 versus cèl·lules no tractades (Ctr) i * P <0, 05 vers cèl·lules tractades amb etoposidi. ( d ) Anàlisis RT-PCR de CD133 i Oct4 en cèl·lules monocapa no tractades i tractades amb etopàsides i en NBSs procedents de les mateixes cèl·lules monocapa. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans, normalitzades a l’expressió de gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH), ± SD de tres experiments independents. ** P <0, 01 contra cèl·lules monocapa. ( e ) activació de p38MAPK en cèl·lules monocapa i en NBSs. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. ° P <0, 05 i °mediat P <0, 01 contra cèl·lules monocapa no tractades i ** P <0, 01 contra cèl·lules monocapa tractades amb etoposida. Les dades s’expressen com una proporció dels nivells de proteïnes fosforilades a proteïnes no fosforilades, els valors dels quals s’han normalitzat prèviament amb els nivells relatius de GAPDH

Imatge a mida completa

A més, tal com es mostra a la figura 6b, el pretractament de SK-N-SH amb SB203580 va provocar una reducció de la viabilitat cel·lular del 50% pel que fa a cèl·lules tractades amb etoposida, i cèl·lules IMR-32 sensibilitzades, resistents a l’etoposida, induint un disminució del 48% de la viabilitat cel·lular.

Tal com es mostra a la figura 6c, l’etoposide per si sol va disminuir el nombre de colònies en un 60% i un 90% en cèl·lules SK-N-SH i IMR-32, respectivament. A més, a les cèl·lules IMR-32, SB203580 només va afectar la clonogenicitat al reduir la clogenicitat en un 35% (Figura 6c). En ambdues línies cel·lulars, el pretractament amb SB203580 va reduir encara més la tumorigenicitat induïda per l’etoposide (figura 6c).

Les cèl·lules SK-N-SH i IMR-32 no tractades van generar NBSs en una setmana aproximadament, i per a cada passatge, el nombre de NBS va ser igual al 30% del procedent de HTLA-230 (dades no mostrades).

L’etoposide o SB203580 sols van inhibir totalment la formació de NBSs en SK-N-SH, però no van alterar el nombre de NBS en IMR-32 (dades no mostrades). Tanmateix, quan les cèl·lules IMR-32 van ser cotreades amb SB203580 i etoposide, es va evitar totalment la formació de NBSs, fins i tot des del primer pas (dades no mostrades). Com es mostra a la figura 6d, les cèl·lules SK-N-SH i IMR-32 monocapa no tractades i tractades amb etopàsides van expressar marcadors de tija CD133 i Oct4. A més, en els vuit passatges, al vuitè número, el CD133 va disminuir notablement (80-90%), mentre que Oct4 no va canviar (figura 6d).

En els NBSs, originats per cèl·lules no tractades SK-N-SH i IMR-32, es va trobar una activació de p38MAPK 7- i 11 vegades respectivament en comparació amb les cèl·lules monocapa (Figura 6e). A més, a les NBSs procedents de cèl·lules IMR-32 tractades amb etopàsids, p38MAPK es va activar en vuit vegades en comparació amb les tractades amb monocapa amb etoposida (Figura 6e). No es va observar cap canvi al MKP-1 (dades no mostrades).

SB203580 plus l’etoposide disminueix els nivells de VEGF, redueix notablement la migració cel·lular / la invasió i la secreció de MMP-9

Les cèl·lules SK-N-SH i IMR-32 no van poder formar estructures de tipus capil·lar (Figura 7a). No obstant això, en aquestes línies cel·lulars, l'etoposide per si sol va reduir el VEGF en un 30% en SK-N-SH i en un 15% en cèl·lules IMR-32 (Figura 7b). De la mateixa manera, SB203580 va disminuir el VEGF en un 38% en SK-N-SH i en un 48% en cèl·lules IMR-32 (Figura 7b). A més, SB203580, en combinació amb etoposida, va reduir encara més el VEGF en un 20% i un 50% en les cèl·lules SK-N-SH i IMR-32, respectivament (Figura 7b).

Image

El cotractament SB203580 redueix notablement la migració, la invasió i l’activitat MMP9 de les cèl·lules tractades amb etoposides. ( a ) Formació d’estructures de tipus capil·lar. Micrografies representatives de la xarxa completa de tubs en cèl·lules no tractades (Ctr) i tractades. Ampliació original × 10. ( b ) Anàlisi immunoblot de VEGF. L'histograma resumeix les dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents: ° P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i ** P <0, 01 vers cèl·lules tractades amb etoposida. Les dades s’expressen com una proporció de VEGF a quantitats de gliceraldehid 3-fosfat deshidrogenasa (GAPDH). ( c ) Test de migració. L'assaig Transwell es va avaluar la migració cel·lular a les cel·les SK-N-SH (panell esquerre) i IMR-32 (panell dret). L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de tres experiments independents. °iami P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. ( d ) Test d’invasió. La invasió cel·lular es va avaluar en les cèl·lules SK-N-SH (panell esquerre) i IMR-32 (panell dret) i es va quantificar comptant el nombre de cèl·lules, que es van desplaçar a la part inferior de la membrana recoberta després de 24 h de tractament. L’histograma resumeix dades quantitatives de mitjans ± SD de sis camps per membrana de tres experiments independents. °iami P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposidi. ( e ) Activitat del MMP9. Els histogrames (SK-N-SH, quadre esquerre i IMR-32, quadre dret) resumeixen dades quantitatives dels mitjans ± SD de tres experiments independents. O ° P <0, 01 contra cèl·lules no tractades (Ctr) i ** P <0, 01 contra cèl·lules tractades amb etoposid

Imatge a mida completa

Com es mostra a la figura 7c, el cotractament de SB203580 amb etoposidi va ser capaç de reduir la migració cel·lular de SK-N-SH en un 77% i de cèl·lules IMR-32 en un 40%, respectivament (Figura 7c). A més, l’etoposide i SB203580 sols van poder reduir la migració cel·lular de SK-N-SH en un 45% i un 40%, respectivament (Figura 7c, quadre esquerre).

El SB203580 sol o en combinació amb l’etoposide va disminuir en un 80-83% la invasivitat d’ambdues línies cel·lulars (Figura 7d).

Tal com es mostra a la figura 7e (plafó esquerre), l’etoposide o SB203580 van reduir en un 30% i 75% la secreció de MMP-9 de les cèl·lules SK-N-SH respectivament. A IMR-32, l'etoposide no va influir en la secreció de MMP-9 (Figura 7e, quadre dret), mentre que SB203580 va reduir el llançament de MMP-9 en un 60% (Figura 7e, quadre dret). No obstant això, l’etoposide més SB203580 van reduir l’alliberament de MMP-9 en un 22% en SK-N-SH i en un 42% en IMR-32, pel que fa a cèl·lules tractades amb etoposidi sols (Figura 7e).

Discussió

En aquest treball, demostrem que HTLA-230 i IMR-32, ambdues cèl·lules amplificades per MYCN, són altament resistents als etoposides, ja que només les dosis que oscil·len entre 10 i 225 μ M són capaces de reduir la supervivència cel·lular. A més, els HTLA-230 són més resistents que els IMR-32 perquè l’etoposida 1, 25 μ M, una concentració que in vitro imita la dosi utilitzada en teràpia clínica, 13 exerceix un efecte antitumorigen menys marcat sobre HTLA-230, mentre que la mateixa dosi d’etoposida disminueix fortament la clonogenicitat de les cèl·lules IMR-32.

Tot i això, totes les cèl·lules NB analitzades són capaces de generar NBSs, però només en cèl·lules amb amplificació MYCN, el tractament amb etoposidi no interfereix amb la formació de NBS. Aquests resultats estan d’acord amb un document que demostra que les cèl·lules derivades del NBS, procedents de tumors cerebrals pediàtrics, tenen una major resistència a l’etoposida en comparació amb les cèl·lules derivades d’una monocapa. 16 A més, s'ha demostrat que només les cèl·lules derivades de l'estadi IV de NB generen esferes, però que l'estat d'expressió MYCN no està relacionat amb la formació de l'esfera. 17

En aquest treball, demostrem que a les NBSs, originades a partir de cèl·lules HTLA-230, es milloren els nivells de marcadors de mareus (CD133 i Oct4), mentre que en els NBS, originats per cèl·lules SK-N-SH i IMR-32, l'expressió de El CD133 es redueix i el Oct4 no canvia. Aquests resultats s’ajusten a un informe que demostra que l’expressió CD133 s’incrementa en les esferes, però no en totes les esferes analitzades derivades de mostres de NB i línies cel·lulars. 17, 18 Probablement, la sobreexpressió dels marcadors de tija contribueix a fer que la HTLA-230 sigui més resistent a l’etoposida i, en aquest sentit, s’ha demostrat que l’expressió de CD133 a les cèl·lules NB està associada a la resistència a la doxorubicina, la vincristina i la cisplatina. 19

D'acord amb altres estudis, 20 hem informat recentment que l'etoposide causa danys en l'ADN i una sobreproducció d'espècies reactives d'oxigen (ROS), 21 que s'han demostrat que medien tant el dany cel·lular com les funcions biològiques. En aquest sentit, aquí mostrem que l’etoposide indueix un augment depenent de la dosi en els nivells del PKCδ 23 proapoptòtic i una disminució paral·lela del PKC α , la isoforma antiapoptòtica. 24

No obstant això, tenint en compte que els PKC són molècules aigües amunt de la via de senyalització ROS que condueixen a danys i apoptosi de l'ADN, 21, 25, 26, és important identificar els mediadors descendents de la resposta del NB a l'etoposide i mostrem que l'etoposide indueix l'activació de Akt i MAPK (és a dir, JNK i p38). Val la pena assenyalar que s'ha activat l'activació de MAPKs en més del 50% de les leucèmies mielogèniques i limfòcites agudes i que els MAPK també són estimulats en altres tumors, 27, 28, implicant que la inhibició de les vies MAPK podria representar una estratègia important per contrarestar el creixement del tumor. En aquest context, els nostres resultats demostren que la viabilitat del HTLA-230 exposat a etopòsid de 1, 25 μ M es redueix pel cotractament amb inhibidors de MAPKs i Akt.

A més, el cotractament amb etoposide i SB203580, un inhibidor específic del p38MAPK, redueix notablement la tumorigenicitat, mentre que PD98059, un inhibidor del MEK, augmenta la capacitat de formar colònies. Aquestes troballes estan en línia amb estudis que demostren, d’una banda, que l’activació p38MAPK té un paper clau en la tumorigenicitat 29 i, d’altra banda, que PD98059 no aconsegueix reduir la toxicitat de l’etoposide. 30

Per primera vegada, hem demostrat que SB203580, sinergitzant amb l’etoposide, inhibeix totalment la formació de NBSs. Probablement això està relacionat amb l'evidència que els NBS provinents de cèl·lules amplificades amb MYCN tenen nivells més alts d'activitat p38MAPK en comparació amb les mateixes cèl·lules cultivades en monocapa i amb les NBS provinents de cèl·lules no amplificades de MYCN. Per confirmar el paper fonamental de l'activació de p38MAPK en la generació i propagació de CSC, es va investigar el paper de MKP-1, un inhibidor endogen dels MAPKs, 31 amb el resultat que, a les cèl·lules NBS, no es van observar canvis en MKP-1. Recentment, també s’ha demostrat que l’activitat p38MAPK millora l’expressió d’un subconjunt específic de gens objectiu Oct4. 32 En aquest sentit, SB203580 plus etoposide no permet la formació de BNS, probablement a causa de la seva actuació en CD133 i Oct4. D’altra banda, s’ha trobat que les cèl·lules positives CD133 mantenen propietats d’autorenovació i CSC implicant Oct4, 15 la transcripció de la qual es detecta en molts carcinomes humans, 33 inclòs NB. 11

Cal destacar que les nostres dades confirmen proves anteriors que indiquen que la kinasa p38 està implicada en la producció de VEGF 34 i en la migració endotelial induïda per VEGF. Un mecanisme addicional d’angiogènesi tumoral és representat pel mimetisme vascular pel qual les cèl·lules canceroses poden adquirir característiques pròpies de les cèl·lules endotelials. 36 Recentment, Pezzolo et al. 11 han suggerit que l’orientació a la capacitat de les cèl·lules HTLA-230 de transformar-se en cèl·lules de tipus endotelial pot contrarestar l’aportació de cèl·lules endotelials derivades de la NB a la recaiguda del tumor i la quimioresistència. 11 Sabem, el nostre treball és el primer que demostra que la capacitat de les cèl·lules HTLA-230 no tractades i tractades d’adquirir les característiques típiques de les cèl·lules endotelials es redueix fortament per la inhibició de p38MAPK i JNK. A més, els nostres resultats demostren que la inhibició de p38MAPK disminueix l'expressió de VEGF a totes les cèl·lules NB analitzades, cosa que suggereix que p38MAPK regulava VEGF mitjançant un mecanisme independent de MYCN. Tanmateix, tenint en compte que només SB203580 redueix el VEGF en cèl·lules tractades amb etoposides, mentre que tant SB203580 com SP600125 inhibeixen el mimetisme vascular, és possible que els inhibidors de p38MAPK i JNK puguin actuar modulant altres factors de creixement i components relacionats amb la matriu. 37

La via p38MAPK és coneguda per regular el desenvolupament del càncer modulant no només l’angiogènesi, sinó també la motilitat i la invasió cel·lular. En aquest context, els nostres resultats demostren que la migració i la invasivitat de cèl·lules NB tractades amb etopàsids depèn de p38MAPK i també suggereixen que la inhibició d’aquesta via podria ser una nova estratègia en limitar la invasivitat de l’etapa IV NB. En conseqüència, s’ha demostrat que SB203580 afecta negativament, in vivo , la invasivitat de cèl·lules de càncer de mama 38, mentre que estudis in vitro demostren que la migració i la invasió de cèl·lules de la bufeta i l’hepatocarcinoma estan vinculades a l’activitat de p38MAPK. 39, 40

Una evidència creixent demostra també que CXCR4, el receptor del factor 1 derivat de l'estroma de la quimiocina (SDF1 / CXCL12), té un paper clau en la biologia del NB 41 i exerceix un efecte promigratori activant p38MAPK. 42 Un altre modulador de la invasivitat del càncer, l'expressió de la qual està associada a l'activació de MAPKs, és COX-2, (ref. 43, 44, 45) que augmenta la migració i modula l'expressió de la ICAM-1, una glicoproteïna de superfície inductible que media les interaccions cèl·lules a cèl·lules dependents de l'adhesió. 46 En aquest sentit, hem demostrat que a les cèl·lules HTLA-230, l'etoposide augmenta notablement l'expressió de COX-2 segons l'evidència que les quimioteràpies / radioteràpies indueixen COX-2 en el càncer. 47 D'altra banda, l'etoposide redueix ICAM-1 i, tot i que no afecta la supervivència cel·lular, redueix notablement la invasivitat cel·lular.

Probablement, l’efecte de l’etoposide és el resultat d’un equilibri entre l’expressió augmentada de COX-2, lligada a una major supervivència i capacitat migratòria, i l’expressió ICAM-1 reduïda, que condueix a una reducció del potencial metastàtic de les cèl·lules tumorals. El cotractament d’etoposide amb SB203580, regulant per descomptat l’expressió d’ambdues proteïnes, d’una banda, determina un efecte citotòxic i antiangiogenètic i, d’altra banda, redueix les propietats invasives i metastàtiques. La demostració que p38MAPK pot regular la migració i la invasivitat de cèl·lules NB es confirma per l’efecte inhibidor de SB203580 sobre l’activitat MMP-9.

Per tant, aquests resultats suggereixen fortament que la combinació d’etoposide amb SB203580 podria ser eficaç per bloquejar el creixement del tumor i les metàstasis.

Alguns estudis preclínics han demostrat que SB203580 és farmacològicament actiu in vivo en diversos models animals i és un potent inhibidor de la producció de citokines amb només efectes menors sobre el sistema immune. 48 Diversos inhibidors de p38 provats per al tractament de malalties inflamatòries han estat ben tolerats amb efectes secundaris mínims. 49 De particular nota, hi ha proves creixents que les diferents quimiocines proinflamatòries estan implicades en el creixement i la invasivitat de la NB. 50

En conclusió, creiem que, a causa de la doble activitat sobre les cèl·lules canceroses i el microambient tumoral, la quimioteràpia estàndard combinada amb inhibidors de p38 podria representar una estratègia terapèutica exitosa per al tractament de la fase IV-NB.

Materials i mètodes

Materials

L’etoposide, el clorur de queleritrina, LY2940042 i PD98059 es van obtenir de Calbiochem (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanya). SB203580 and SP600125 were from Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA). Matrigel (basement membrane matrix) was from Becton, Dickinson and Company (Franklin Lakes, NJ, USA).

Cell cultures and treatments

The MYCN-amplified human stage-IV NB cell lines, HTLA-230 and IMR-32, and the MYCN-non-amplified stage-IV SK-N-SH cells were obtained from Dr. V Pistoia (G Gaslini Institute, Genoa, Italy). The cell line was tested for mycoplasma contamination (Mycoplasma Reagent Set; Euroclone spa, Pavia, Italy). Cell morphology and proliferation were analyzed after thawing and within eight passages in culture. Cells were cultured in RPMI1640 (Euroclone) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Euroclone), 2 mM glutamine (Euroclone), 1% penicillin/streptomycin (Euroclone), 1% sodium pyruvate (Sigma) and 1% of amino-acid solution (Sigma). Cells were treated for 24 h with etoposide doses ranging from 0.07 to 225 μ M, and then, in a series of experiments, were pre-treated for 1 h with various enzymatic inhibitors of different signaling pathways: 0.1 μ M chelerythrine chloride (PKC, pan inhibitor), 500 nM LY290042 (PI-3-kinase/Akt inhibitor), 50 μ M PD98059 (MAP kinase kinase, MEK, inhibitor), 10 μ M SB203580 (p38MAPK inhibitor) or 4 μ M SP600125 (JNK inhibitor).

The stock solutions of etoposide and chemical inhibitors were prepared in DMSO and pilot experiments have demonstrated that the final DMSO concentrations did not change the cell responses analyzed.

Test MTT

Cell viability was determined using the dimethylthiazolyl-2-5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma) staining. Briefly, cells were seeded into 96-well plates (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) and then treated with etoposide and/or inhibitors for 24 h. Next, the cells were incubated with 0.5 mg/ml MTT for 3 h at 37 °C. After incubation, the supernatant was discarded, insoluble formazan precipitates were dissolved in HCl (0.1 N in isopropanol) and the absorbance at 570 nm was recorded using a microplate reader (EL-808; BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA).

Clonogenic assay

NB cells (150 per well) were seeded in six-well plates (Corning) and treated with etoposide and/or inhibitors for 24 h. Subsequently, the medium was changed and the cells were maintained in drug-free medium for 20 days. Cells were then fixed with methanol and stained with crystal violet (0.5% in water with 50% methanol). Colonies containing more than 50 cells were counted and the images were acquired with a Nikon Coolpix L22 camera (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).

Soft-agar colony formation assay

NB cells were plated into six-well plates in the presence or absence of etoposide and/or inhibitors for 24 h. Anchorage-independent growth was carried out as follows: base agar (0.5% agar, RPMI1640 and 10% FBS) was added to each well and allowed to solidify, and then an equal volume of top agar (0.35% agar, RPMI1640 and 10% FBS), containing untreated or treated cells (10 3 cells per cm 2 ), was added to each well. Plates were incubated in a 5% CO 2 humidified incubator at 37 °C for 25 days. Colonies were stained with 0.005% crystal violet. Colonies containing more than 25 cells were counted by a Leica DMIRB microscope (Leica, Wetzlar, Germany) and the images were acquired with a Nikon Coolpix L22 camera (Nikon).

Sphere culture of NB cells

After treatment, NB cells were cultured in DMEM-F12 knockout medium (Invitrogen, Paisley, UK) containing 1% penicillin/streptomycin (Euroclone), 2% B27 supplement (Invitrogen), 40 ng/ml bFGF (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) and 20 ng/ml epidermal growth factor (EGF; Invitrogen). 51 Half of the medium was then replaced with fresh culture medium every 7 days.

The self-renewal capacity of NBSs was determined by counting the spheres in the liquid culture. Growth curves were established by mechanically dissociating the passaged tumor spheres, plating 16 × 10 4 single cells in 25 cm 2 flasks and assessing the NBSs number at every passage.

Anàlisi RT-PCR

Total RNA was extracted using TRI ZOL reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Total RNA (1 μ g) was reverse-transcribed into cDNA by random hexamer primer and SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen).

Amplification of cDNA by a polymerase chain reaction was performed using AmpliTaq Polymerase (Invitrogen) and specific primers for CD133, Oct4 and GAPDH. Primer sequences were: CD133 Fw – 5′-ACATCTCAACATTAATGAGC-3′; CD133 Rv – 5′-TTTGCTTCTAGATCATATGC-3′(222 bp); Oct4 Fw – 5′-CAGTGCCCGAAACCCACAC-3′; Oct4 Rv – 5′-GGAGACCCAGCAGCCTCAAA-3′ (160 bp); GAPDH Fw–5′-AGCCACATCGCTCAGACACC-3′; and GAPDH Rv – 5′-TGAGGCTGTTGTCATACTTCTC-3′ (426 bp).

Fluorescence microscopy analysis of apoptotic and necrotic cells

For the assessment of apoptosis and necrosis, cells were analyzed as described previously. 25 Following treatment, cells were incubated with 0.5 μ g/ml fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled recombinant Annexin-V and 0.5 μ g/ml propidium iodide (PI; BioVision, Mountain View, CA, USA). Cells were then visualized and counted (four fields of 200–400 cells) by fluorescence microscopy using a Leica DMIRB microscope (Leica) with a dual filter set for FITC and rhodamine. Images were acquired with a Leica DCF320 camera. Cell death was evaluated as a percentage of Annexin-V (apoptotic) or PI-positive (necrotic) cells.

Detection of ROS production

Detection of ROS was performed as reported previously. 25 After treatment, cells were incubated with 20 μ M 2′, 7′-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH-DA; Sigma) and the accumulation of DCF was analyzed at 530/485 nm. The cells were then observed and counted (four fields of 200–400 cells) by fluorescence microscopy using a Leica DMIRB microscope with a standard set of filters for fluorescein. The images were acquired with a Leica DCF320 camera.

DNA damage

Cells were seeded on chamber slides (Iwaky Seiyaku Co., Tokyo, Japan) treated with etoposide, fixed with paraformaldehyde (4% in PBS pH 7.5) and permeabilized with Triton 0.1%.

Nonspecific antibody binding was blocked by a 30 min incubation with 1% BSA and 1% gelatine. Cells were treated with anti- γ -H2AX antibody (1 : 500; Abcam, Cambridgeshire, UK) and then incubated with an FITC-conjugated anti-mouse antibody (Upstate, Lake Placid, NY, USA). Nuclei were identified by PI staining. Images were collected by fluorescence microscopy (Leica DMIRB microscope) with a dual filter set for FITC and rhodamine. The images were acquired with a Leica DCF320 camera.

Anàlisi d’immunoblot

Immunoblots were carried out according to standard methods 25 using monoclonal mouse antibodies, anti-PKC α (Upstate, Lake Placid, NY, USA), anti-β-actin (Sigma), anti- γ -H2AX, anti-ICAM-1, anti-JNK (Abcam), anti-VEGF (Abnova, Taipei, Taiwan), and polyclonal rabbit antibodies, anti-human PKC δ , anti-Akt, anti-phospho-Akt (Thr308), anti-phospho-Akt (Ser473), anti-p38MAPK, anti-phospho-p38MAPK (Cell Signalling Technology Inc., Danvers, MA, USA), anti-phospho-JNK (Thr183) and anti-phospho-JNK (Tyr185), anti-CXCR4, anti-COX2 (Abcam), anti- MKP-1 and anti-GAPDH (Sigma).

Anti-mouse and anti-rabbit secondary antibodies were coupled with horseradish peroxidase (Amersham International, Buckinghamshire, UK). Proteins were visualized with an enzyme-linked chemiluminescence detection kit according to the manufacturer's (Amersham) instructions. Chemiluminescence was monitored by exposure to film and the signals were analyzed under non-saturating conditions with an image densitometer connected to Quantity One software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Formation of capillary-like structures

In vitro formation of capillary-like structures was carried out on untreated and treated HTLA-230 cells (2 × 10 4 cells per well), seeded into a 96-Matrigel-coated well plate, adding endothelial basal medium in the presence or absence of VEGF (15 ng/ml) and bFGF (50 ng/ml). 11 In parallel, 10 μ M sulforaphane was added as a control inhibitor of the capillary-like structure formation. Samples were analyzed over a 4–48 h period with a microscope (Leica DMIRB) using × 10 and × 20 lenses.

'Scratch' assay

HTLA-230 cells were plated into 24-well plates and cultured until confluent. A 200 μ l pipette tip was used to 'scratch' the cell monolayers and then etoposide and/or inhibitors were added for 24 h. Photomicrographs were taken using an inverted microscope (Leica DMIRB) equipped with a × 10 lens. To evaluate the cell migration rate, images were recorded at time 0 and 24 h after the treatments. The distance between the two margins of the wound was analyzed by Adobe Photoshop 7.0.1.

Test de migració

Cell migration assay was carried out using the Transwell system (Corning) equipped with 8- μ m pore size polycarbonate filters. Cells (5 × 10 4 ), suspended in serum-free medium, were plated into the upper chambers in the presence or absence of etoposide and/or inhibitors and allowed to migrate towards the lower chamber containing medium with 5% FBS, as a chemoattractant, for 24 h. Subsequently, the unmigrating cells in the upper compartment were removed using cotton swabs and the cells that had migrated to the lower surface of the filters were fixed with glutaraldehyde 2.5% (Sigma) and stained with Gill's hematoxylin no.1 solution (Sigma), following the manufacturer's instructions. The quantity of cells that had migrated through the filter was evaluated by microscopy analysis (Leica DMIRB microscope) using a × 10 lens.

Test d’invasió

In vitro invasion assay was carried out in BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers (BD) with 8 μ m pores into 24-well plates, following the manufacturer's instructions. Cells (5 × 10 4 ), suspended in serum-free medium, were plated into the upper coated chambers in the presence or absence of etoposide and/or inhibitors and allowed to migrate towards the lower chamber containing medium with 5% FBS, as a chemoattractant, for 24 h. Subsequently, the unmigrated cells in the upper chamber were gently scraped off the filter. The quantity of cells that had migrated through the filter was evaluated by crystal violet staining and microscopy analysis (Leica DMIRB microscope) using a × 10 lens.

MMP activity

MMP activity in the conditioned media was determined by zymography, according to the methods described by Bernhard and Muschel. 52 Cells were cultured and treated in serum-free medium. Subsequently, the conditioned medium was harvested and centrifuged at 14 000 rpm × 10 min at room temperature and the resulting supernatant was concentrated by using Amicon Ultra Centrifugal Filters (Millipore Ireland Ltd, Country Cork, UK). The total protein amount was determined by the BCA method (Pierce, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).

Substrate polyacrylamide gel electrophoresis was carried out by a modified protocol of Heussen and Dowdle, 53 using the gelatine Ready Gel Zymogram 10% (Bio-Rad Laboratories). Briefly, samples were mixed with Laemmli buffer (in a ratio of 3 : 1), warmed at 37 °C for 30 min and subjected to gel electrophoresis. Subsequently, the gel was incubated for 48 h in developing buffer (50 mM Tris (pH 7.4), 0.2 M NaCl, 1% Triton X-100, 0.02 sodium azide and 5 mM CaCl 2 ).

After this step, the gel was stained for 1 h (0.2% Coomassie Blue, 30% ethanol and 10% acetic acid) and then de-stained in a solution containing 10% acetic acid. The gelatine digestion was analyzed with an image densitometer connected to Quantity One software (Bio-Rad Laboratories).

Anàlisi de dades

Results were expressed as mean±SD from at least three independent experiments. The statistical significance of parametric differences among sets of experimental data was evaluated by one-way ANOVA and Dunnett's test for multiple comparisons.

Glossari

bFGF

factor bàsic de creixement del fibroblast

COX

cyclooxygenase

CSCs

cancer stem-like cells

CXCR

C–X–C chemokine receptor

FEG

factor de creixement epidèrmic

FBS

sèrum boví fetal

FITC

isotiocianat de fluoresceïna

ICAM

intercellular adhesion molecule

JNK

c-Juny N-terminal cinasa

MAPK

proteïna quinasa activada amb mitogen

MEK

MAP kinase kinase

MKP-1

MAPK phosphatase-1

MMP

matrix metalloprotease

MTT

dimethylthiazolyl-2-5-diphenyltetrazolium bromide

NB

neuroblastoma

NBSs

neurospheres

PI

propidium iodide

PI-3 kinase

phosphatidylinositol 3-kinases

PKC

proteïna cinasa C

ROS

espècies reactives a l'oxígen

SDF

stromal-derived factor

VEGF

vascular endothelial growth factor