Pml La disrupció del cos nuclear deteriora la detecció del trencament de doble cadena i la reparació en apl | mort i malaltia cel·lular

Pml La disrupció del cos nuclear deteriora la detecció del trencament de doble cadena i la reparació en apl | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Trencaments d'ADN de doble cadena
  • Leucèmia
  • Oncogènesi

Resum

Les proteïnes implicades en la reparació de doble fil (ADN) de l'ADN es localitzen dins dels cossos nuclears de leucèmia promielocítica (PML-NBs), la disrupció de la qual es troba en l'arrel de la patogènesi aguda promelocítica aguda (APL). El tractament amb àcid tot-retinoic (RA) indueix la degradació de PML-RAR α , restaura les funcions PML-NB i provoca la diferenciació de cèl·lules terminals de explosions APL. Tot i això, encara falta el paper precís de la oncoproteïna PML-RAR α associada a APL i de la integritat PML-NB en la resposta del DSB en la leucemogènesi APL i la supressió del tumor. Les explosions de leucèmia primària aïllades dels pacients amb APL van mostrar alts nivells de fosforilació de H2AX ( γ- H2AX), un sensor inicial de DSBs. En abordar les conseqüències de la resposta DSB induïda per radiació ionitzant (IR) en explosions APL primàries i línies de cèl·lules mieloides que responen a la RA i -resistents portant PML-RAR α endògena o ectòpica, abans i després del tractament amb RA, vam trobar que la disrupció dels PML-NB està associat a la resposta DSB retardada, tal com es revela per la cinètica deteriorada de la desaparició dels punts γ- H2AX i 53BP1 i l'activació de l'ATM i dels seus substrats H2AX, NBN i CHK2. La interrupció de la integritat PML-NB per PML-RAR α també afecta la resposta DSB induïda per IR en un model de ratolí preleucèmic d’APL in vivo . Proposem la interrupció PML-NB dependent de la oncoproteïna i la deterioració de la DDR com a esdeveniments precoços rellevants en la tumorigènesi APL.

Principal

La resposta al dany de l'ADN (DDR) inclou la detenció del cicle cel·lular i l'activació transcripcional i post-translacional de gens implicats en la reparació de l'ADN i en el desencadenament d'apoptosi. Les deficiències en DDR són fonamentals per a l’etiologia de la majoria de càncers humans. 1

Les ruptures de doble cadena d’ADN (DSB) provenen de fonts endògenes i exògenes, incloent errors de replicació, mutàgens químics i radiació ionitzant (IR). 2 La fase de detecció de la resposta DSB inclou el seu reconeixement pel complex MRE11 / RAD50 / NBN, l’activació de proteïnes ATM, la fosforilació d’HistA H2AX a Ser139 ( γ- H2AX), MDC1 i el reclutament 53BP1. γ-H2AX és un sensor DSB inicial per a la posterior acumulació i modificació post-translacional (PTM) de proteïnes de senyalització i reparació per formar els anomenats focs induïts per IR (IRIF). 3, 4, 5, 6, 7, 8 Finalment, els DSBs s'eliminen a través de les vies d'unió final no homòloga (NHEJ) o de la reparació de recombinació homòloga (HRR). 9

Moltes proteïnes implicades en la DDR es localitzen dins dels cossos nuclears promulocítics (PML) -nuclears (PML-NBs). Els 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 PML-NB són orgànuls nuclears implicats en processos cel·lulars rellevants per a la supressió del tumor (per exemple, PTM, DDR, regulació transcripcional, inducció d’apoptosi i senescència). 16, 17, 18, 19, 20, 21 PML-NB augmenten el nombre i canvien la seva distribució subnuclear en resposta a danys en l'ADN i representen estructures on es combinen, ancoren i / o es modifiquen post-traduccions els complexos proteics. 11, 13, 15, 16, 22 PML també sofreixen PTM, SUMOylation que representa una de les principals modificacions necessàries per a la correcta biogènesi NB i regulació de la resposta cel·lular al dany de l'ADN. 23

Es va informar de nivells aberrants de proteïna PML i pèrdua d'integritat PML-NBS en leucèmia promielocítica aguda (APL) i en altres tumors. El gen PML es va clonar originalment en cèl·lules leucèmiques APL que transportaven la t (15; 17) detectable en més del 95% de les APL. Aquesta translocació implica els gens PML i els gens receptors de l’àcid retinoic (RAR α ) i genera el gen de fusió PML-RAR α . 25, 26, 27 PML-RAR α actua com a repressor transcripcional que antagonitza la diferenciació mieloide i promou la capacitat d’autorenovació de les cèl·lules iniciadores per l’APL. 28, 29 PML-RAR α també inhibeixen de manera competitiva l’oligomerització de proteïnes PML de tipus salvatge (WT), provocant la interrupció de les NB-PML en les "microspeckles" nuclears. A les cèl·lules APL, el tractament amb àcid retinoic (RA) restableix la integritat NB, reverteix la inhibició transcripcional mediada per PML-RAR α i indueix la degradació de PML-RAR α i la diferenciació de cèl·lules terminals. 29, 31, 32

Fins a la data, encara no se sap fins a quin punt la reparació del DSBS depèn de la funció PML i PML-NBS. Aquí, la relació existent entre la integritat PML-NBS i la detecció, senyalització i reparació de DSBS induïda per IR s'ha investigat en cèl·lules leucèmiques derivades d'individus APL, línies cel·lulars mieloides que expressen o no el PML-RAR α i en un PML-RAR α model de ratolí preleucèmic in vivo . Les dades obtingudes mostren que l'expressió de PML-RAR α en cèl·lules mieloides causa un dany basal i una resposta DSBS defectuosa, destacant el paper pivot de les PML-NB en la coordinació i la regulació dels esdeveniments precoç i tardà de la DDR en APL. En general, els nostres resultats suggereixen que la interrupció de PML-RAR α depenent del PML-NBS i la deterioració de la DDR són esdeveniments primerencs rellevants en la tumorigenesi APL.

Resultats

La integritat dels PML-NB és necessària perquè es tornin a unir els DSB adequats

La doble tinció d’immunofluorescència amb anticossos anti-PML i anti-γ-H2AX va permetre la detecció de PML-NB desmuntats i un nombre elevat de punts γ-H2AX en explosions primàries aïllades en diagnòstic de tres pacients amb APL, que albergaven la translocació cromosòmica t (15; 17 ) resultant en el producte de fusió PML-RAR α (també confirmat per RT-PCR, figures 1a i b). Les característiques biològiques i clíniques d’aquests casos d’APL es detallen a la taula complementària S1. Es van observar resultats similars a la línia cel·lular NB4 derivada d’APL i a la seva subclona NB4-MR4 resistent a la RA (figura 1a i figura suplementària S1A).

Image

Integritat PML-NB i cinètica de desfosforilació γ- H2AX. ( a ) Imatges representatives de la doble anàlisi d'immunofluorescència de γ- H2AX (Alexa Fluor 488, fluoròfor verd) i PML (Alexa Fluor 610, fluoròfor vermell) en els punts de tractament APL no tractats (Ctrl) i exposats a 1 Gy de rajos X i fixat després de 0, 5, 3 i 24 h (imatge cel·lular: camp brillant; imatges de microscòpia confocal, ampliació × 63) i cèl·lules NB4 tractades o no amb 1 μ M RA durant 72 h, i després exposades a IR i fixades després de 0, 5, 3, 24 i 48 h (comptadors: DAPI; imatges de microscòpia confocal, ampliació × 63). ( b ) Quantificació del nombre mitjà de focs / cèl·lules γ- H2AX i ( c ) anàlisi de la capacitat de reunió mesurada com a percentatge de DSB en explosions APL no tractades i irradiades derivades de 3 individus diferents, i cèl·lules NB4 i NB4-MR4 no tractades o es va tractar amb 1 μ M RA durant 72 h i es va irradiar amb 1 Gy. Per als gràfics de reunió de NB4 i NB4-MR4 DSB; * i ** indiquen diferències significatives de cèl·lules NB4 tractades amb RA respecte a les cèl·lules NB4 no tractades i les cèl·lules NB4-MR4. Els valors mitjans es van derivar de l’anàlisi de 100 cèl·lules en 3 experiments independents ± SD Per a DSBs, el nombre mitjà d’indrets γ- H2AX / cèl·lula mesurable a 0, 5 hores després de la presa d’IR com a 100%. * P <0, 05; ** P <0, 01. L'anàlisi confocal es va realitzar mitjançant el microscopi confocal Leica LCS (Leica Microsystems, Heidelberg, Alemanya)

Imatge a mida completa

La capacitat de reparació de DSBs després de 1 Gy de raigs X es va avaluar com a valor mitjà de focs / cèl·lules γ- H2AX i com a percentatge de DSB residuals en cada moment. En els explosions primàries d’APL, el nombre de focs γ- H2AX va assolir un pic després de 0, 5 h a partir de l’IR, i va disminuir lentament després de 3 h (45 45 punts / cèl·lula i el 80% dels DSB no reparats). Un nombre elevat de DSB no reparats van persistir després de 24 hores des de l’IR, destacant un retard en la reparació del DSBS en explosions d’APL (∼ 12 punts / cèl·lula i un 24% de DSBs no reparats) (figures 1b i c).

La microscòpia confocal també va revelar un elevat nombre de focus / cèl·lules γ- H2AX a les cèl·lules no tractades NB4 i resistents a la RA NB4-MR4 (figures 1 i b i figura suplementària S1). El pic en el valor mitjà de focs / cèl·lules γ- H2AX es va assolir a 0, 5 hores d'IR tant en cèl·lules no tractades amb RA com amb RA. Una diferència significativa en el valor mitjà de focs / cèl·lules γ- H2AX i en el percentatge de DSB residuals es va observar després de 3 hores d’IR (~ 80% de DSBs no reparats en cèl·lules NB4, NB4-MR4 i NB4 tractades amb RA ; ~ 60% de les DSB no reparades en cèl·lules NB4 tractades amb RA; P <0, 05; Figures 1b i c). De forma similar a les explosions d’APL, el perfil de reincorporació de DSB a les cèl·lules NB4 va demostrar que a les 24–48 h des de l’IR el nombre de DSB persistents era significativament superior a les cèl·lules NB4 i a les cèl·lules NB4-MR4 que a les cèl·lules NB4 tractades amb RA (figures 1b i c). En aquestes cèl·lules es van restaurar els PML-NB després de la degradació de PML-RAR α i la granulopoiesi es va induir de manera dependent i del temps IR, de manera que es revela una expressió augmentada del marcador de diferenciació mieloide CD11b (Figures complementàries S1B i C).

Mitjançant l'anàlisi immunoblot, vam observar que γ -H2AX era indetectable o gairebé no detectable a les cèl·lules progenitores hematopoietiques de CD34 + (HPCs) i a les cèl·lules mononuclears CD34-MNCs, respectivament, mentre que es van observar nivells elevats de γ- H2AX en expressió de PML-RARα. mostres de tres pacients amb APL, així com en cèl·lules NB4 i NB4-MR4 (Figura 2a). El tractament RA en cèl·lules NB4 va disminuir els nivells de γ- H2AX en comparació amb cèl·lules no tractades. Després de l’IR, a les cèl·lules NB4 els nivells més alts de γ- H2AX van ser detectables després de 3 h, persistint fins a 24 h, mentre que a les cèl·lules tractades amb RA els nivells de γ- H2AX van assolir un pic a 0, 5 h i van disminuir gradualment fins a 24 h (Figura 2b) . El tractament IR no va exercir cap efecte sobre els nivells d’expressió RAR α o PML-RAR α en explosions d’APL primària i cèl·lules NB4 (Figura 2c).

Image

( a ) Anàlisi immunoblot representatiu de la fosforilació H2AX i H2AX al residu Ser139 en cèl·lules humanes no tractades CD34 i CD34 + aïllades de la sang perifèrica de donants normals, en tres pacients APL, en cèl·lules NB4 i NB4-MR4. ( b ) Anàlisi immunoblot representatiu de la fosforilació H2AX en cèl·lules NB4 tractades o no amb 1 μ M RA durant 72 h i després irradiats amb 1 Gy de rajos X i lisat després de 0, 5, 3 i 24 h. ( c ) Anàlisi immunoblot representatiu dels nivells d'expressió RAR α i PML-RAR α en explosions APL, NB4, U937 / PR9, i U937 / MT exposades a IR i lisades després de 0, 5 h; abans de la irradiació, les cèl·lules NB4 es van tractar o no amb 1 μ M RA durant 72 h, mentre que les cèl·lules U937 / PR9 es van tractar o no amb 100 μ M ZnSO 4 durant 8 hores i després amb 1 μ M RA durant 72 h, segons s’indica; es van sondar filtres amb anticossos anti-RAR α , i es va utilitzar tubulina com a control de càrrega. ( d ) Quantificació del nombre mitjà de focs / cèl·lules γ- H2AX i ( e ) anàlisi de la capacitat de reunió mesurada com a percentatge de DSB en cèl·lules U937 / PR9, U937 / MT i U937 / WT tractades o no amb 100 μ M ZnSO 4 durant 8 hores i / o amb 1 μ M RA durant 72 h, segons s’indica; les cèl·lules es van exposar després a l’IR i es van fixar en els moments indicats. Els valors mitjans es van derivar de l’anàlisi de 100 cèl·lules en tres experiments independents ± SD Per a DSBs, el nombre mitjà d’indrets γ- H2AX / cèl·lula mesurable a 0, 5 h després de la presa d’IR com a 100%. ** P <0, 01. Per al gràfic de reincorporació UB37 / PR9 DSB; ** indica diferències significatives de cèl·lules U937 / PR9 tractades amb ZnSO 4 respecte a les cèl·lules de control U937 / PR9. L’anàlisi confocal es va realitzar mitjançant el microscopi confocal Leica LCS (Leica Microsystems)

Imatge a mida completa

Les cèl·lules U937 / PR9 tractades amb IR induïdes per expressar la oncoproteïna α -PML-RAR per ZnSO 4 van proporcionar resultats similars als observats en explosions APL i cèl·lules NB4. Les cel·les U937 / PR9 + ZnSO 4 van mostrar ~ 80%, 20% i 10% de DSB persistents després de 3, 24 i 48 h de IR, respectivament (figures 2d i e). Després del tractament RA en cèl·lules U937 / PR9 + ZnSO 4, amb resultat de degradació de PML / RARα i reforma de PML-NBS, el percentatge de DSB persistents va ser del 60%, 10% i 2% després de les 3, 24 i 48 h, respectivament. Curiosament, els valors similars de focs / γ- H2AX i perfils de reunió DSBS eren mesurables, abans o després del tractament amb ZnSO 4 i / o RA, en línies cel·lulars mieloides que expressaven la proteïna PML WT com U937 / MT, U937 / WT, HL60, i HL60-R, un subcloni resistent a la RA de HL60 (figures 2d i e i figures suplementàries S2A – C). Cal destacar que el tractament IR no va exercir cap efecte sobre els nivells d’expressió RARα o PML-RARα a les cèl·lules U937 / PR9 i U937 / MT (figura 2c). Això va suggerir, a més, un paper per a la interrupció del PML-NB després de l'expressió Pα-RAR α a la capacitat de reincorporació de les cèl·lules mieloides del DSB.

La integritat dels PML-NBs és necessària per a la contractació de 53BP1 als DSBs

53BP1 s’acumula dins dels PML-NB i es recluta a l’IRIF després de la inducció DSBS, promovent l’activació de la senyalització de reparació. 33 Per tant, es va estudiar la cinètica DSB comptant el nombre de punts focals 53BP1 a les cèl·lules APL primàries i a les cèl·lules NB4 i NB4-MR4 després de 0, 5, 3 i 24 h per irradiació amb 1 Gy. Vam trobar que la integritat PML-NBS és necessària per a la localització de 53BP1 als nuclis i per a la formació de focus 53BP1 després de la inducció del DSBS. De fet, el 53BP1 amb prou feines es va detectar en explosions APL no irradiades i cèl·lules NB4, probablement a causa d’una dèbil expressió basal de 53BP1 o de la seva dispersió panuclear a les PML-NB desmuntades. Per contra, 53BP1 va colocalitzar amb PML dins dels PML-NB restaurats després del tractament RA de cèl·lules NB4 (Figura 3a). Després de danys induïts per IR, el nombre de focs 53BP1 i la colocalització amb PML van ser significativament més baixos en explosions d’APL no tractades amb RA i cèl·lules NB4 i NB4-MR4 en comparació amb cèl·lules NB4 tractades amb RA (Figures 3a-c). Així, es pot produir la restauració dels punts 53BP1 dins dels PML-NB reformats com a conseqüència de la degradació Pα-RAR α induïda per RA.

Image

Integritat PML-NB i contractació de 53BP1 als DSBs. ( a ) Imatges representatives de la desaparició de focs 53BP1 en APL explosions no tractades (Ctrl) i exposades a 1 Gy i fixades després de 0, 5, 3 i 24 hores, i en cèl·lules no tractades amb RA (NB4) i RA (NB4 + RA) no irradiat (Ctrl) i exposat a IR i fixat després de 0, 5 h (imatge cel·lular: camp brillant; imatges de microscòpia confocal, ampliació × 63; 53BP1 (Alexa Fluor 488, fluoròfor verd); PML (Alexa Fluor 610, fluoròfor vermell)) . ( b ) Quantificació de focs / cèl·lules 53BP1, indicada com el valor mitjà de focs 53BP1 en explosions APL, cèl·lules NB4 i NB4-MR4 no tractades o tractades amb 1 μ M RA durant 72 h, i cèl·lules U937 / PR9 ja no tractades o exposades per a 8 h a 100 μ M ZnSO 4 i després tractats o no amb 1 μ M RA durant 72 h. Després del tractament amb ZnSO 4 i / o RA, les cèl·lules es van irradiar amb 1 Gy i es van fixar en els punts de temps indicats. ( c ) Quantificació d'esdeveniments d'associació de focs 53BP1 amb PML per nucli en explosions APL, NB4, NB4-MR4 i cèl·lules U937 / PR9. ( d ) Quantificació d'esdeveniments d'associació d'indrets de focs / cèl·lules 53BP1 i 53BP1 amb PML per nucli a les cèl·lules U937 / MT. Abans de la irradiació, les cèl·lules U937 / MT es van tractar o es van exposar durant 8 h a 100 μ M ZnSO 4 i després es van tractar o no amb 1 μ M RA durant 72 h. Els valors mitjans es van derivar de l’anàlisi de 100 cèl·lules en tres experiments independents ± SD * P <0, 05; ** P <0, 01. L’anàlisi confocal es va realitzar mitjançant el microscopi confocal Leica LCS (Leica Microsystems)

Imatge a mida completa

Es va avaluar la eficàcia de la DSB per unir-se a les cèl·lules que expressen la oncoproteïna α -PML-RAR i a les cèl·lules que expressen la PML WT comptant el nombre de focs / cèl·lules 53BP1 en cèl·lules no tractades i irradiades (figures 3b i d i figura suplementària S2D). Després de 0, 5 h des de l’IR, les explosions d’APL i les cèl·lules NB4 van mostrar un nombre mitjà de 53BP1 punts / cèl·lula inferiors als calculats en cèl·lules que expressen WT PML o en cèl·lules on PML-RAR α va ser degradada per RA. Després de 3 hores des de l’IR, les explosions d’APL i les cèl·lules NB4 van mostrar un nombre de punts 53BP1 significativament superiors als mesurables a les cèl·lules que expressaven PML WT o on el RA PML-RAR va ser degradat per RA. Finalment, després de 24 i 48 h a partir de l’IR, el valor mitjà residual de foci / cèl·lula 53BP1 anotat en cèl·lules que expressaven la proteïna de fusió PML-RAR α va ser significativament superior en comparació amb les que expressaven PML WT (figures 3b i d i figura suplementària S2D).

El PML-RAR α no augmenta els cromosòmics en l'estabilitat, la fase S i la mort cel·lular

Per avaluar si els focs / γ- H2AX i 53BP1 residuals observats després de 24 i 48 h a partir d’IR en explosions d’APL i cèl·lules d’expressió de PML-RAR α poden correlacionar-se amb la inestabilitat del cromosoma, es va realitzar l’anàlisi multicolor FISH (mFISH) en cèl·lules NB4., ja sigui no tractat o exposat a RA, en combinació amb exposició a 1 Gy. El cariotip de NB4 es va establir tenint en compte les translocacions conservades que apareixen en> 90% de les cèl·lules analitzades en controls. El cariotip era hipotetraploide i es pot resumir de la manera següent: 80 XX, −X, −X, 1, −3, −5, +7, −8, −14, −15, −18, −19, −19, - 19, −19, −21, −22, t (8′ –9), (9′ – 8), t (10–19), t (10–19), t (14–19), t (15 ′ –17), t (16–5) t (17′ – 15), t (17′ – 15) (figures 4a i b). L’anàlisi dels intercanvis cromosòmics a cada mostra es va fer ignorant les translocacions basals observades a les cèl·lules de control. Els resultats obtinguts van indicar que la sola RA no va exercir cap efecte sobre la freqüència de les aberracions cromosòmiques sobre els valors de control i no va modificar la freqüència de ruptura induïda per IR (figura 4b). Tot i que la freqüència de ruptura es manté invariable, el pretractament RA va reduir la freqüència dels intercanvis de cromosomes induïts per IR (de 2 a 0, 9 intercanvis / cèl·lula en control NB4 i mostres irradiades tractades amb RA, respectivament), mentre que va augmentar la freqüència de fragments en excés cromosòmic (de 1, 8 fins a 3, 9 fragments / cèl·lules en control de NB4 i mostres irradiades tractades amb RA, respectivament) (figura 4b). L’única diferència observada en mostres tractades amb RA versus NB4 no tractades va ser en termes de qualitat del dany del cromosoma induït per IR en lloc de quantitat (pauses totals). Malauradament, no es va poder realitzar una anàlisi citogenètica en mostres d’APL primària a causa de la velocitat de proliferació molt lenta de explosions aïllades de la sang perifèrica que es bloquegen en la fase G0 / G1 del cicle cel·lular (figura 4c).

Image

Dany cromosòmic, distribució del cicle cel·lular i apoptosi en cèl·lules que expressen PML-RAR α . ( a ) Imatge representativa d'un cariotip NB4 tacat per mFISH. El cariotip es va establir tenint en compte les traduccions conservades que apareixen en> 90% de les cèl·lules analitzades en controls. Les metàfases es van capturar amb el microscopi Axio Imager M1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanya). El software ISIS va realitzar un cariotipat i una anàlisi citogenètica de cada cromosoma. ( b ) Freqüència per cèl·lula d’aberracions cromosòmiques (és a dir, fragments, intercanvis i ruptures) després de la irradiació amb 1 Gy en cèl·lules NB4 no tractades o exposades a 1 μ M RA durant 72 h. ( c ) Distribució en cicle cel·lular de explosions APL i de cèl·lules NB4 no tractades o tractades amb 1 μ M RA durant 72 h, després irradiades i fixades després de 24 h. ( d ) Distribució del cicle cel·lular de cèl·lules U937 / PR9 no tractades o tractades amb 100 μ M ZnSO 4 durant 8 h per induir l'expressió PML-RAR α i després irradiada i fixada després de 24 h. ( e ) Població sub-G1 analitzada per citometria de flux en explosions APL i en cèl·lules NB4 no tractades o tractades amb 1 μ M RA durant 72 h, i després irradiada i fixada després de 24 h. ( f ) Població sub-G1 analitzada per citometria de flux en cèl·lules U937 / PR9 no tractada o tractada amb 100 μ M ZnSO 4 durant 8 h, i després irradiada i fixada després de 24 h. Els valors mitjans es van derivar de tres experiments independents ± SD ** P <0, 01

Imatge a mida completa

Com que H2AX està fosforilat o bé durant la fase S del cicle cel·lular o com a conseqüència de la inducció de la mort cel·lular, 34 es va analitzar el perfil del cicle cel·lular i la població sub-G1 de explosions APL i línies cel·lulars mieloides. En els explosions APL, el> 90% de les cèl·lules eren en G1, el 2% en S i el 8% en les fases G2 / M del cicle cel·lular (figura 4c), mentre que la població sub-G1 era ~ 4% (figura 4e). L’anàlisi del cicle cel·lular en cèl·lules NB4 i U937 / PR9 tractades o no amb RA i ZnSO 4, respectivament, no tractades o irradiades amb 1 Gy, va demostrar que l’elevat nombre de focs / cèl·lules γ- H2AX es va anotar en cèl·lules que expressaven PML-RAR α. no es correlaciona amb el percentatge de cèl·lules de la fase S (figures 4c i d). A més, a les cèl·lules NB4 i U937 / PR9, no es va observar cap associació entre el nombre de focs / γ- H2AX i mort cel·lular, tant en condicions basals com després de 24 h per exposició a IR (figures 4e i f). En general, les dades obtingudes van indicar que els alts nivells basals de focs γ- H2AX observats en explosions APL i cèl·lules que expressen PML-RAR α no estan associades al cicle cel·lular en fase S o a la mort cel·lular.

La integritat dels PML-NBs és necessària per activar els caixers

L’ATM kinasa, un regulador crític de la DDR, està fosforilat ràpidament al residu Ser1981 en resposta a l’IR, i la seva forma activa al seu torn fosforilava H2AX a Ser139, així com diversos altres components de la DDR (per exemple, NBN al Ser 343 i CHK2 a Thr68). 2 Es va valorar el paper de la integritat PML-NBS en la fosforilació ATM a Ser1981 i l’activació en resposta a l’IR. L’ATM va resultar mal activat en explosions d’APL que no expressen PML-RAR α que no irradien, la seva forma fosforilada amb Ser1981 colocalitzant amb PML a 3 hores de la irradiació amb 1 Gy (figura 5a). De forma similar a les explosions primàries d’APL, els punts pSer1981-ATM amb prou feines es van detectar en cèl·lules no irradiades NB4 i U937 / PR9 + ZnSO 4 (figures 5b i c). A les cèl·lules que expressen PML-RAR α , l’activació de l’ATM i la colocalització amb PML van ser ben detectables després de 3 h a partir de l’IR, mentre que a les cèl·lules que expressen el WT PML (és a dir, U937 / WT i U937 / PR9) es va acumular una acumulació de pSer1981-ATM en PML Els focus ja eren visibles després de 0, 5 h a partir de l’IR (figura 5c i figura suplementària S3A). Curiosament, el tractament RA tant en cèl·lules NB4 com U937 / PR9 induïdes per Zn va restablir el patró de colocalització pSer1981-ATM / PML a les PML-NB després de 0, 5 hores d'IR (figures 5b i c).

Image

Integració PML-NB i activació de caixers. Doble immunofluorescència dels focs pSer1981-ATM (Alexa Fluor 488, fluoròfor verd) i PML (Alexa Fluor 610, fluoròfor vermell) realitzats en cèl·lules no tractades o irradiades amb 1 Gy i fixades després de 0, 5 i 3 h. Imatges representatives de l’anàlisi realitzada a ( a ) explosions d’APL (imatge de cèl·lula: camp brillant), ( b ) Cèl·lules NB4 no tractades o tractades amb 1 μ M RA durant 72 hores anteriors a l’IR (contraban: DAPI) i ( c ) U937 / PR9 cèl·lules ja no tractades o exposades durant 8 h a 100 μ M ZnSO 4 i després no tractades o tractades amb 1 μ M RA durant 72 h anteriors a IR (contrasenya: DAPI). Alguns senyals de colocalització han estat ressaltats i marcats a la cel·la per un quadrat blanc. Imatges de microscòpia confocal, ampliació × 63; Microscopi confocal Leica LCS (Leica Microsystems)

Imatge a mida completa

La integritat dels PML-NB és necessària per a la transducció del senyal DSBS

Experiments de coimmunofluorescència amb anticossos anti-pSer1981-ATM i anti-pSer343-NBN van indicar que la fosforilació ATM i NBN es va induir significativament després de 3 h d’irradiació amb 1 Gy en cèl·lules que expressaven Pα-RAR α (Figura 6). A les cèl·lules α PML-RAR tractades amb RA (NB4 + RA i U937 / PR9 + RA induïdes per Zn) i en cèl·lules que expressen les cèl·lules WT PML (cèl·lules U937 / WT i U937 / PR9), hi ha un nombre elevat de focus pSer1981-ATM, colocalitzant-se amb pSer343-NBN, era visible a 0, 5 hores des de l’IR; a 3 h del IR, van desaparèixer els focs pSer1981-ATM mentre que els indrets NBN van persistir (les figures 6b i c i la figura suplementària S3B). Aquests resultats estan d’acord amb la funció proposada de NBN en diverses fases de la DDR. 35, 36

Image

Integritat PML-NB i fosforilació NBN dependent de l'ATM. Doble immunofluorescència dels focs pSer1981-ATM (Alexa Fluor 488, fluoròfor verd) i pSer343-NBN (Alexa Fluor 610, fluoròfor vermell) realitzats en cèl·lules no tractades o irradiades amb 1 Gy i fixades després de 0, 5 i 3 h. Imatges representatives de l’anàlisi realitzada a ( a ) explosions d’APL (imatge de cèl·lula: camp brillant), ( b ) Cèl·lules NB4 no tractades o tractades amb 1 μ M RA durant 72 hores anteriors a l’IR (contraban: DAPI) i ( c ) U937 / PR9 cèl·lules ja no tractades o exposades durant 8 h a 100 μ M ZnSO 4 i després tractades o no amb 1 μ M RA durant 72 h anteriors a IR (contrasenya: DAPI). Alguns senyals de colocalització han estat ressaltats i marcats a la cel·la per un quadrat blanc. Imatges de microscòpia confocal, ampliació × 63; Microscopi confocal Leica LCS (Leica Microsystems)

Imatge a mida completa

L’anàlisi d’immunoblot també va demostrar que a les cèl·lules que expressaven Pα-RAR α , les proteïnes ATM, NBN i CHK2 estaven fosforilades en resposta a la IR encara que amb una cinètica retardada (figura 7a). De fet, el senyal de fosforilació de ATM, NBN i CHK2 va assolir un pic després de 3 h des de l’IR, la fosforilació ATM va ser visible fins a 24 hores des de la irradiació (figures 7a i b), mentre que en cèl·lules que expressen WT PML, l’ATM, NBN, i les proteïnes CHK2 van ser fosforilades després de 0, 5 h a partir de l’IR, i es va reduir fortament el senyal de fosforilació després de 3 i 24 h (figures 7a i b i figura suplementària S4A). Aquestes dades indiquen que la integritat PML-NBS és necessària per a una correcta activació dels eixos ATM-CHK2. 22 A més, l’anàlisi d’immunoblot mostrava que els nivells d’expressió i fosforilació de H2AX, NBN i CHK2 no es van veure afectats a les cèl·lules U937 / PR9 tractades o no amb ZnSO 4, després exposades a cicloheximide i finalment irradiades, cosa que suggereix que la síntesi de proteïna de novo no està implicada. en els defectes de senyalització DDR detectats a les cel·les APL (Figura 7c).

Image

Fosforilació de l'ATM kinasa i els seus substrats en cèl·lules que expressen PML-RAR α . ( a ) Anàlisi immunoblot de pSer1981-ATM, pSer343-NBN i fosforilació pThr68-CHK2 en explosions APL, NB4, NB4-MR4 i cèl·lules U937 / PR9. Abans de les cèl·lules IR, NB4 i NB4-MR4 no es van tractar o es van exposar a 1 μ M RA durant 72 h, mentre que les cèl·lules U937 / PR9 no es van tractar o es van exposar durant 8 h a 100 μ M ZnSO 4, i després es van tractar o no amb 1 μ M RA durant 72 h. Les cèl·lules es van exposar a 1 Gy de raigs X i es van lisar després de 0, 5, 3 i 24 h. ( b ) Anàlisi immunoblot de la fosforilació ATM en el residu Ser1981 després de 24 hores a partir de l’IR a les cèl·lules NB4 i U937 / PR9. ( c ) Les cèl·lules U937 / PR9 es van tractar per primer cop amb 100 μ M de ZnSO 4, després es van exposar a 10 μ g / ml cicloheximid, i finalment es va irradiar amb 1 Gy i es va lisar després de 0, 5 h. Els immunoblots es van realitzar mitjançant anticossos anti- γ- H2AX, anti-pSer343-NBN, anti-NBN, anti-pThr68-CHK2 i anti-CHK2. Els blocs presentats són exemplificatius dels resultats obtinguts de dos experiments independents

Imatge a mida completa

Detecció i reparació defectuosa de DSBS en un model de ratolí preleucèmic d’APL

Per avaluar el paper de l’expressió PML-RAR α en la detecció i senyalització DSBS in vivo , es va utilitzar el model preleucèmic d’APL (és a dir, ratolins PR). 37 En aquest model, la malaltia es desenvolupa després d'una llarga latència, cosa que suggereix que alteracions addicionals cooperen amb PML-RAR α per al desenvolupament de leucèmia. Vam confirmar que a Lin - HPCs d’aquests ratolins els nivells d’expressió de RAR α i PML-RAR α no van ser afectats per l’IR. Cal destacar que els nivells de γ- H2AX van ser més elevats en PR no tractats en comparació amb els ratolins WT (figures 8a i b).

Image

Validació in vivo de la DDR en el model de ratolí preleucèmic d’APL. El WT i els ratolins preleucèmics eliminats per PML-RAR α (PR) van ser irradiats amb 5, 5 Gy de raigs X i sacrificats després de 0, 5, 3, 6 i 24 h. Les cèl·lules linals es van aïllar de la medul·la òssia de tres ratolins combinats. ( a ) Anàlisi immunoblot de l'expressió RAR α i PML-RARα, i de la fosforilació H2AX en els residus Ser139, en ratolins WT i PR no tractats i irradiats. ( b ) Imatges representatives de la doble anàlisi d'immunofluorescència de γ- H2AX (Alexa Fluor 488, fluoròfor verd) i PML (Alexa Fluor 610, fluoròfor vermell) en fòrums no tractats i irradiats amb ratolins WT i PR. ( c ) Imatges representatives dels focs 53BP1 en ratolins WT i PR no tractats i irradiats. ( d ) L'anàlisi de reincorporació dels DSBs es va informar com el valor mitjà de focs / cèl·lules γ-H2AX i com el percentatge de DSB residuals en ratolins WT i PR no tractats i irradiats. La reparació del DSBS també es va analitzar comptant el nombre de foci / cèl·lula 53BP1 en ratolins WT i PR no tractats i irradiats. Els valors mitjans es van derivar de l’anàlisi de 100 cèl·lules de tres experiments independents ± SD * P <0, 05, ** P <0, 01. ( e ) Imatges representatives de la doble anàlisi d'immunofluorescència de pSer1981-ATM (Alexa Fluor 488, fluoròfor verd) i pSer343-NBN (Alexa Fluor 610, fluoròfor vermell) en fòrums de WT i PR. ( f ) Anàlisi immunoblot de la fosforilació ATM al residu Ser1981, fosforilació NBN a Ser343, fosforilació CHK2 a Thr68, fosforilació ADN-PK a Ser2056 i expressió RAD51. Imatge de la cel·la: camp brillant; imatges de microscòpia confocal, ampliació × 63; Microscopi confocal Leica LCS (Leica Microsystems)

Imatge a mida completa

Els ratolins de RP HPC van mostrar un patró nuclear microspecked de PML-NBs el nombre del qual va augmentar després de la irradiació amb 5, 5 Gy (figura 8b). La cinètica de la desfosforilació γ- H2AX i el reclutament de 53BP1 en els DSBs es va retardar en els ratolins PR preleucèmics en comparació amb els animals WT, amb la persistència de nivells significativament més alts de danys no reparats després de 24 h d’IR ( P <0.05; Figures 8b – d) . A més, l'activació de l'ATM, així com la fosforilació dels seus substrats NBN i CHK2, es va retardar en els ratolins PR en comparació amb els ratolins WT (figures 8e i f). Per analitzar la via de reparació de DSBS activa en els ratolins WT i PR, es va estudiar l'estat de l'ADN-PK i el RAD51 que tenen un paper clau en la reparació de NHEJ i HRR, respectivament. Els resultats van demostrar que l'ADN-PK no es va fer fosforilat després de la infecció IR en ratolins WT o PR, mentre que RAD51 va ser induït a les 3 h en ratolins WT irradiats (figura 8f). Aquests resultats suggereixen que l'expressió PML-RAR α deteriora l'activació de HRR induïda per IR in vivo .

Discussió

La interrupció dels PML-NB per PML-RAR α és un distintiu de l’APL, una malaltia model per comprendre les vies leucemogèniques dirigides per una oncoproteïna. 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 Aquí, informem que els PML-NB tenen un paper fonamental en la regulació dels passos primerencs i tardans de la detecció, senyalització i reparació de DSB induïts per IR a les cèl·lules mieloides de in vitro i in vivo . Aquests esdeveniments poden dependre del context cel·lular, ja que l'esgotament / la sobreexpressió de PML i l'expressió ectòpica de PML-RAR α en cèl·lules no hematopoietiques i els tumors sòlids només afecten les fases tardanes del HRR. 16

Els resultats obtinguts en un model de ratolí preleucèmic PML-RAR α de ratolí suggereixen fortament que la interrupció del PML-NBs induïda per PML-RARα està associada a un deteriorament de la DDR i representa un esdeveniment precoç en la patogènesi APL. L'evidència obtinguda en cèl·lules mieloides que expressen o no el PML-RAR α i en les línies de cèl·lules mieloides resistents a la RA suggereixen que la reforma de la PML-NB i la degradació oncoproteïna, dos esdeveniments que contribueixen a l'efecte terapèutic de la RA en APL, estan estretament correlacionats amb la restauració de DDR a cèl·lules APL. A més, els nostres resultats apunten a una implicació directa de la unió RA a la PML-RAR ogen endògena en la restauració de la integritat PML-NB i DDR.

D’acord amb els descobriments anteriors obtinguts en les línies cel·lulars APL i en els precursors hematopoètics de ratolins que expressaven PML-RAR α , 14, 38, vam demostrar que les explosions primàries d’APL i Lin - HPCs de ratolins PR es caracteritzaven per nivells més elevats de γ- H2AX que els detectables. en els HPC normals humans i murins. Curiosament, es van trobar nivells elevats de focs γ- H2AX en tumors humans i cèl·lules cultivades, 39 durant la fase S del cicle cel·lular i durant l’apoptosi. L’anàlisi del cicle cel·lular en explosions d’APL i en cèl·lules que expressen PML-RAR α sembla que exclou la possibilitat que la fosforilació de H2AX depèn del percentatge de cèl·lules en fase S o d’esdeveniments apoptòtics. Curiosament, l'expressió PML-RAR α augmenta la capacitat dels inhibidors de la histona deacetilasa (HDACi) per induir danys i apoptosi d'ADN afectant l'expressió de gens implicats en el mecanisme de reparació de l'ADN. 38 Això pot explicar la selectivitat de HDACi per provocar la mort de cèl·lules canceroses en determinades cèl·lules transformades. 40

Com que γ- H2AX representa un biomarcador del DSB, però no un component funcional del DDR, 2, 3, 4, es va analitzar més la detecció DSBS mitjançant 53BP1, una proteïna que s’acumula dins dels PML-NBs i està implicada en la reparació dels DSBs. 41, 42 L’anàlisi a temps de la contractació de 53BP1 en els DSBs en models in vitro i in vivo d’APL va indicar que la interrupció dels PML-NBs frena la seva contractació en els DSBs després de l’IR. 53BP1 es va associar indistintament amb els PML-NBs i la seva distribució al nucli depenia de la integritat de les PML-NBs. A més, vam observar que a les cèl·lules mieloides, el nombre d’associacions PBB i PML segueix el perfil de reincorporació del DSB, el que indica una associació de les dues proteïnes als punts DSB in vivo . De fet, es va observar un reclutament defectuós de 53BP1 als llocs danyats a les cèl·lules que expressaven PML-RAR α , i es va restablir la correcta localització mitjançant tractament RA.

En general, els nostres resultats suggereixen que l’expressió de la proteïna de fusió PML-RAR α , en destruir la integritat PML-NBS, retarda la cinètica de reincorporació DSBS en explosions i línies cel·lulars d’APL humana i en progenitors hematopoètics del model de ratolí APL. Això pot contribuir a la persistència del nombre més elevat de punts γ- H2AX i 53BP1 en moments més llargs d’IR a les cèl·lules APL (en comparació amb els progenitors mieloides que expressen proteïnes PML normals i PML-NBs), semblant a la deficiència en la reparació d’un subconjunt específic. de DSB descrites en cèl·lules defectuoses de DDR. 43 Com que les NB-PML es defineixen com a cistelles que contenen proteïnes implicades en la resposta del DSBS, la seva interrupció pot provocar una dispersió panuclear de proteïnes DDR i, per tant, un defecte en el lligam de DSBS. 10, 11, 13, 15, 16, 44

La interrupció dels PML-NBs per l'expressió PML-RAR α no augmenta la inestabilitat cromosòmica en cèl·lules NB4 tractades o no amb RA i / o IR, tot i que s'ha suggerit una capacitat compromesa de mantenir una estabilitat genòmica com a part de la patogènesi APL. La majoria dels esdeveniments somàtics en els genomes APL semblen ser mutacions aleatòries de fons a les cèl·lules hematopoietiques que van adquirir l'esdeveniment iniciador de PML-RAR α . 45, 46 Un ampli espectre d’anormalitats cromosòmiques adquirides i recurrents, que poden actuar com a esdeveniments secundaris i que podrien explicar la leucemogènesi APL, es van informar mitjançant una anàlisi de polimorfisme d’un nucli nucleòtic d’alta resolució (SNP-A) en un diagnòstic i remissió aproximats del 50%. mostres de 48 casos d’APL. Aquestes anomalies genètiques eren indetectables per la citogenètica convencional. 47 Gairebé el 90% d’aquestes lesions no eren exclusives d’APL, però recurrents en leucèmies mieloides agudes no APL i altres neoplàsies hematològiques. 47, 48, 49, 50 En particular, les mutacions presents en les leucèmies humanes també es van identificar mitjançant la seqüenciació d’un genoma de ratolí APL. 51 Per tant, l'esdeveniment inicial PML-RAR α pot ser necessari, però no suficient, per provocar APL; Es poden produir cops addicionals, en gran part desconeguts i possiblement associats a la capacitat perjudicial de les HPC per reparar correctament les lesions de l’ADN, 52 i, en definitiva, conduir a l’expansió clonal de les explosions leucèmiques.

Les PTM regulen múltiples funcions biològiques de PML i de desmuntatge i reconstrucció de PML-NBS durant la DDR, 21 i al seu torn les PML-NB regulen les PTM de proteïnes nuclears dependents de les cinases ATM i ATR. 11, 12, 13, 53 En aquest context, els nostres resultats suggereixen l’existència d’un mecanisme de retroalimentació entre els PML-NB i l’eix ATM-NBN-CHK2 en la resposta DSBS. Al marge d'un paper directe d'aquestes proteïnes en la modulació dels rols PML-NB en la resposta DSBS induïda per IR, pot ser necessària la integritat de PML-NBS per activar ràpidament la detecció, senyalització i reparació del DSBS. Els nostres resultats posen de manifest que la interrupció del PML-NBS per PML-RAR α afecta fortament l’activació de l’ATM, així com la fosforilació CHK2 i NBN. Això suggereix que la integritat dels PML-NBs és necessària per detectar correctament els DSB per activar l'ATM i permetre la fosforilació dependent de l'ATM de proteïnes localitzades dins de les NB-PML. 11, 12, 52 El retard de la contractació de 53BP1 a les DSBs en cèl·lules que expressen PML-RAR α , que contenen els PML-NB alterats, juntament amb l’augment deteriorat dels nivells de RAD51 en els ratolins PR, suggereixen que el mecanisme HRR es facilita per PML intacta. -NBs in vivo .

Les dades obtingudes en explosions primàries d’APL humanes i en cèl·lules mieloides, confirmades encara més en un model preleucèmic de ratolí d’APL, van posar de manifest el paper rellevant de les NB-PML en la coordinació i la regulació de la DDR. Aquests resultats posen de manifest els esdeveniments ocorreguts a l’aparició de l’APL, cosa que suggereix que l’expressió de PML-RAR α pertorba els PML-NB, provoca danys en l’ADN i és responsable d’un defecte en els passos inicials i tardans de la DDR que en al seu torn, té un paper en la patogènesi i la progressió de l'APL.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

  4. 4.

    Figura suplementària 4

Glossari

APL

leucèmia promielocítica aguda

DDR

Resposta de danys en l'ADN

DSB

Trencament de doble fil d’ADN

IR

Radiació ionitzant

γ- H2AX

Fosforilació H2AX a Ser139

HDACi

inhibidor de la histona deacetilasa

HPC

progenitors hematopoètics

HRR

reparació de recombinació homòloga

IRIF

focs induïts per radiació ionitzant

MFISH

PEIX multicolor

NHEJ

unió final no homòloga

PML

leucèmia promielocítica

PML-NB

PML cos nuclear

PTM

modificació post-traduccional

RA

àcid retinoic tot trans

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)