El polimorfisme de la proteïna associada a la resistència a diversos medicaments i el gen 3 està associat a resultats en leucèmia limfoblàstica aguda en la infància | la revista farmacogenòmica

El polimorfisme de la proteïna associada a la resistència a diversos medicaments i el gen 3 està associat a resultats en leucèmia limfoblàstica aguda en la infància | la revista farmacogenòmica

Anonim

Temes

  • Leucèmia limfocítica aguda
  • Farmacogenètica

Resum

Les proteïnes relacionades amb la resistència a diversos medicaments (MRP) 2, 3 i 5 participen en l’eflux de fàrmacs utilitzats en el tractament de leucèmia limfoblàstica aguda (ALL). Es van investigar els polimorfismes d’aquests gens per una associació amb respostes al tractament en 273 pacients TOTS de la infància. L’ al·lel MRP3 A-189 del polimorfisme AT regulador es va associar amb una reducció de la supervivència sense esdeveniments ( P = 0.01). Els resultats es van mantenir significatius després de l’ajust per a comparacions múltiples i en l’anàlisi multivariant. Entre els pacients amb un esdeveniment, els portadors d’A-189 tenien nivells plasmàtics de metotrexat significativament més elevats ( P = 0, 03). MRP3 A-189 també va suposar quatre vegades més gran risc de recaiguda al sistema nerviós central ( P = 0, 01). Els pacients amb aquest al·lel tendien a tenir menor freqüència de trombocitopènia grau 2 ( P = 0, 06). El test del reporter gènic va demostrar que l'haplotip marcat per l'A-189 tenia una activitat promotora superior ( P 0.0.01). Com a conclusió, el polimorfisme MRP3 A-189 T es va associar amb respostes de tractament a TOTS, probablement a causa del canvi en l’eflux de MRP3.

Introducció

A causa de la introducció de teràpies efectives adaptades al risc combinades juntament amb la prevenció de la malaltia del sistema nerviós central (SNC), el tractament de la leucèmia limfoblàstica aguda pediàtrica (ALL) ha millorat molt en les últimes quatre dècades. 1, 2 No obstant això, la resistència a la teràpia en un nombre significatiu de nens 3 és un obstacle important per a l'èxit del tractament, mentre que el tractament intensiu també té efectes secundaris importants. Les variacions genètiques poden explicar, almenys en part, diferències en la predisposició individual per respondre al tractament. Els estudis farmacogenètics que s’han realitzat en TOTS els pacients van identificar variacions genètiques en diverses vies farmacèutiques que poden contribuir a la variabilitat de les respostes al tractament. 1, 4 La biodisponibilitat dels fàrmacs que s’utilitzen per tractar TOT depèn, entre d’altres factors, de l’activitat i de l’expressió de proteïnes relacionades amb la resistència a diversos medicaments (MRPs o transportadors de la subfamília C d’unió de trifosfat d’adenosina). 5, 6 MRP s’expressen a les membranes de molts teixits barrera que contribueixen així a la disposició de plasma, licors i drogues intracel·lulars. Es va demostrar que 7, 8 MRP van unir i transportar metotrexat (MTX), un component clau de tot el tractament. 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14 L’augment de l’expressió MRP, tal com es mostra in vitro, pot provocar una menor acumulació de MTX cel·lular que confereix un nivell de resistència moderat a alt. A més, la capacitat dels MRP de transportar folates naturals i leucovorina pot reduir el nivell d'aquests compostos i, per tant, influir indirectament en la citotoxicitat antifolada. 5, 9 MRP també es van mostrar eflux 6-mercaptopurina, vincristina i doxorubicina igualment utilitzats en tots els protocols de tractament. 15 Com que l’expressió i la funció del MRP presenten una àmplia variabilitat, es va hipòtesi que les variacions constitutives dels gens MRP podrien contribuir a la variabilitat en farmacocinètica i / o resultats clínics. Fa poc vam demostrar que els polimorfismes del gen MRP4 poden afectar el risc de recaiguda i la toxicitat relacionada amb el tractament en pacients amb ALL. 16 A continuació, s'informa de l'anàlisi dels polimorfismes dels gens MRP 2 , 3 i 5 , de la seva associació amb els resultats de la malaltia ALL i de la toxicitat relacionada amb el tractament, així com de la valoració funcional del polimorfisme MRP3 que hem afectat significativament a les respostes al tractament en TOTS.

Pacients i mètodes

Estudiar la població i els objectius finals en l'anàlisi

Els nens inscrits a l'estudi són 273 caucàsics (el 97, 5% dels pacients eren d'origen francès-canadenc procedents de la regió geogràfica similar) diagnosticats amb ALL a l'Hospital Sainte-Justine, Mont-real, Canadà, entre gener de 1989 i desembre de 2003. Els pacients van ser sotmesos tractament amb els protocols de Dana-Farber Cancer Institute ALL Consortium DFCI 87-01, 91-01, 95-01 o 2000-01. 17, 18, 19 Els respectius números de pacients tractats amb aquests protocols van ser 12, 60, 121 i 80. Les dosis de MTX rebudes van ser comparables entre els protocols de tractament. En el protocol 87-01, els pacients van ser aleatoritzats per rebre una dosi d’inducció de MTX com a dosi baixa o alta dosi (HD, 4 gm m –2, seguit de rescat de leucovorina). 20 Només es van incloure en aquest estudi pacients que van rebre HD-MTX. Als protocols 91-01, 95-01 i 2000-01 es va donar un sol HD-MTX durant la inducció. En tots els protocols, els pacients van rebre dosis setmanals de 30 mg m- 2 durant les fases de consolidació (pacients amb risc estàndard) i manteniment (tots els pacients). El tractament dirigit pel sistema CNS 20 estava compost per teràpia intratecal (IT) amb o sense teràpia de radiació cranial (CRT). Els pacients que van ser assignats al risc estàndard (SR) en el protocol 87-01 van rebre IT sense radiació. Les noies SR el protocol 91-01 van ser tractades només amb TI. Els nois de SR el protocol 95-01 van ser aleatoritzats per rebre IT més freqüent sols o combinats amb CRT. El 2000-01, tots els pacients d’SR van rebre IT més freqüents sense CRT. El tractament informàtic es componia de protocols MTX / cytarabine en els protocols 87-01 i 91-01 i el 95-01 i 2000-01 estava compost per MTX / cytarabine / hydrocortisone només per a pacients que van rebre IT. 20 dosificació informàtica segons l’edat i la dosi IT MTX oscil·lava entre els 6 i els 12 mg. Es van obtenir 19 mostres de pacients després del consentiment informat i el Comitè d'Ètica de l'Hospital va aprovar el protocol d'estudi.

L’associació de genotips amb TOTS els resultats es va avaluar mitjançant supervivència sense esdeveniments (EFS), supervivència lliure de malalties i anàlisi de supervivència general tal com es va descriure anteriorment. Es va definir que els nens que van recaure, van tenir una fallida en la inducció o van morir i que es va definir que els nens que van recaure o van patir una inducció havien patit una malaltia. La toxicitat de la medul·la òssia i la funció hepàtica es va basar en els resultats de les proves de laboratori setmanals recollides durant el tractament de consolidació i manteniment, tal com s’ha descrit anteriorment. 21 La mitjana de setmanes valorades per pacient va ser de 80. La toxicitat es va classificar mitjançant els criteris habituals per a esdeveniments adversos del National Cancer Institute i es va estimar la freqüència dels esdeveniments tòxics per a cada pacient. Es van disposar de dades de toxicitat per a 174 pacients que es van avaluar de la relació entre genotips i probabilitats de l'EFS. Per tal de regular la teràpia de rescat, es controlen rutinàriament les concentracions de MTX després de l'administració de HD-MTX. El primer punt en què es va realitzar aquest mesurament variava d’un protocol a un altre DFCI i els nivells de plasma MTX a 24, 36 i 48 h després d’HD-MTX van ser disponibles per a 119, 255 i 208 pacients, respectivament, que es van avaluar per la relació entre Genotips MRP i probabilitats EFS. La mesura dels nivells de plasma MTX es va realitzar per immunosanvi de polarització de fluorescència (TDx Abbott Laboratories, Chicago, IL, EUA) seguint les instruccions del fabricant.

Genotipat

Es van seleccionar catorze polimorfismes en els gens MRP2 , MRP3 i MRP5 ubicats a les regions de gens reguladors i codificadors de les bases de dades NCBI (Centre Nacional per a la Biotecnologia de la Informació) SNP (polimorfisme de un sol nucleòtid) (//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) (Taula 1). Tots els polimorfismes seleccionats es van analitzar en 49 controls per estimar la freqüència d’al·lel, el desequilibri d’enllaç (LD) i la fase haplotip (figura 1). Els tags seleccionats (suficients per definir haplotips comuns) amb freqüència 5% es van genotipar posteriorment en 273 TOTS els pacients.

Taula completa

Image

Polimorfismes gènics i proteïnes relacionades amb la resistència a diversos medicaments ( MRPs ) i haplotips derivats. Es presenten visualitzacions de desequilibri d’enllaç de Haploview (LD) per als seleccionats polimorfismes MRP2 ( a ), MRP3 ( b ) i MRP5 ( c ) amb valors r 2 de parella. La freqüència d’al·lels menors en la població control es dóna per sota de la posició de cada polimorfisme d’un sol nucleòtid (SNP). L’al·lel menor es subratlla en la substitució base, que s’indica d’al·lel ancestral a derivat. Els SNP del gen MRP2 exclosos de l’anàlisi de pacients de leucèmia limfoblàstica aguda (ALL) a causa del r 2-95% amb SNP adjacents estan indicats per asterisc. Els haplotips derivats s'anomenen arbitràriament pels números. La freqüència en els controls es dóna al costat de cada haplotip.

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

Els polimorfismes del gen MRP es van amplificar per PCR, utilitzant 15-25 ng d'ADN genòmic obtingut a la remissió. La seqüència de parells d’imprimació avançada i inversa utilitzats per a l’amplificació de cada SNP s’exposa a la taula 1. Les reaccions de PCR es van realitzar en un volum final de 25 μl amb 0, 4–0, 6 μM de cadascun dels primers, 0, 1–0, 15 mM de cadascun dels dNTP., 1-2, 5 mM MgCl 2 i 1, 0 U de Taq polimerasa (Platí, Invitrogen, Burlington, ON, CA). Per a l'amplificació de polimorfismes MRP2-993, MRP3-1696 i MRP5-1629, es va afegir, respectivament, 2, 6 i 2% de dimetilsulfoxid. Es va realitzar una amplificació de 40 cicles compostos de 30 s a 94 ° C, 30 s a 59-68 º C, segons els polimorfismes provats, i 30 s a 72 ° C. El genotipat es va realitzar mitjançant hibridació oligonucleòtida específica de l’al·lel, tal com es va descriure anteriorment. 22 La seqüència de sondes d’oligonucleòtids específiques d’al·lel específiques per a les variants provades es mostra a la taula 1. El subconjunt de mostres es va genotipar per duplicat per assegurar la reproducció del genotip. L'amplificació no va ser igualment reeixida per a tots els loci analitzats explicant la menor diferència en el nombre total de genotips.

Estadístiques

El programari PHASE, versió 2.0, va obtenir les estimacions de la fase LD i de l’haplotip en individus de control. 23 Els tag SNP es van seleccionar a partir d’informació LD ( r 2 0.94, figura 1) mitjançant el programari Haploview (Daly Lab al Broad Institute, Cambridge, MA, EUA). Les etiquetes SNP amb la freqüència d'al·lel menor (ele5%) es van conservar per a anàlisis posteriors a TOTS els pacients. Les diferències de supervivència, estimades per l'anàlisi de Kaplan-Meier per a pacients amb diferents genotips, es van avaluar mitjançant un test log-rank. Els temps d’esdeveniment, malaltia o mort es van mesurar com el temps entre el diagnòstic i l’esdeveniment d’interès; per als casos censurats, es corresponia amb el temps entre el diagnòstic i el punt final de l'estudi (5 anys després del tractament, és a dir, 84 mesos després del diagnòstic) o al setembre de 2007. La proporció de perillositat (relació de perillositat amb un interval de confiança del 95%) per a les variants genètiques es va estimar mitjançant l’anàlisi de regressió de Cox, amb i sense la inclusió dels factors pronòstics comuns classificats segons la predicció de risc de recaiguda (nois o noies; edat inferior a 1 any, 1–9, 99 i més de 10 anys; glòbul blanc per sota o per sobre de 50 × 10 9 l –1 ; tipus de cèl·lules B o T; índex d’ADN superior o inferior a 1, 16 i grup estàndard o d’alt risc. 16 El tipus de protocols de tractament amb DFCI (DFCI 87-01 – DFCI 2000-01) era també es va introduir en l'anàlisi multivariant.

Es va analitzar la freqüència de toxicitat hematològica (basada en el nombre de glòbuls blancs i el nombre absolut de neutròfils i plaquetes) i la toxicitat hepàtica (basada en els nivells d’aspartat aminotransferasa i transanasa alanina) 21 en relació amb genotips MRP . Per a l'anàlisi es van considerar els graus 3 i 4 de la toxicitat per a cadascun dels paràmetres anteriors, excepte la trombocitopènia per a la qual es va trobar també el grau 2. La comparació entre grups es va realitzar mitjançant el test de Mann-Whitney. Mann – Whitney es va utilitzar per comparar entre els genotips els valors transformats en log de nivells MTX (μ M) mesurats a 24, 36 i 48 h després de HD-MTX. Totes les anàlisis que avaluen l’impacte dels genotips / haplotips es van realitzar pel paquet estadístic SPSS (Chicago, IL, EUA), versió 17.0. Es va realitzar una correcció de la taxa de descobriment falsa per ajustar-se a diverses comparacions mitjançant el programari de valor Q i l’enfocament de bootstrap descrit a Storey et al. 24 El valor P es va estimar per a un nivell de taxa de descobriment fals entre 0, 05 i 0, 15.

Examen del reporter gènic i expressió de mRNA

Els fragments específics de l’ aplotip corresponen a 1250 pb de la regió promotora proximal de MRP3 aigües amunt del lloc d’iniciació de la transcripció (regió 5 ′ flanquejar) i que abastaven variants de –189 i −140 es van amplificar a partir d’ADN genòmic d’individu amb genotip conegut. La regió incloïa un segment de -127 a −23-bp aigües amunt del lloc d'inici de la traducció que és important per a l'expressió MRP3. Es van clonar 25 fragments al vector bàsic sense promocions pGL3 (Promega, Madison, WI, EUA). Es van seqüenciar construccions corresponents a tres haplotips per confirmar la presència dels llocs polimorfs previstos. La placentària humana Jeg-3, el càncer de coll uterí HeLa i les línies de cèl·lules de l'hepatoma HepG2 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA) van ser co-transfectades amb 100 ng de plasmidi de luciferasa de tirolines que contenien la construcció al·lèlica corresponent i 0, 5 ng de renilla impulsada per SV40. plàsid luciferasa pRL-SV40 per controlar l'eficiència de transfecció. La transfecció es va realitzar com es va descriure anteriorment. 26 L’activitat de renilla luciferasa del control pRL-SV40 de control es va utilitzar per normalitzar els resultats de l’activitat de la tirolina luciferasa de les construccions al·lèliques (l’activitat relativa de la luciferasa es va expressar com a mitjana ± sd). Es van realitzar 26 experiments similars amb plasmidi buit de pGL3, presentant control negatiu. Cada experiment es va realitzar per triplicat i es va valorar la diferència entre haplotips en l'activitat de reporter gènic mitjançant l'anàlisi d'unidireccional de la variància amb l'ajust post hoc de Bonferroni per a la comparació del nombre de parells.

Resultats

Catorze polimorfismes localitzats en regions de regulació i codificació dels gens MRP2 , MRP3 i MRP5 van ser seleccionats de la base de dades dbSNP a NCBI. Inicialment vam genotipar aquests SNPs en 49 controls d’origen caucàsic per estimar la freqüència al·lèlica i determinar la fase haplotip. La menor freqüència d’al·lels va oscil·lar entre el 5 i el 49% (figura 1) i les freqüències del genotip estaven d’acord amb l’equilibri de Hardy-Weinberg. L’organització de SNPs seleccionats en haplotips, juntament amb la freqüència en la població de control es dóna per a cada gen MRP de la figura 1. La informació sobre dos polimorfismes MRP2 va ser capturada per altres SNP, segons es va basar en el coeficient de LD, R 2 0.96, resultant en un total de 12 polimorfismes de MRP etiquetats que es van analitzar posteriorment en pacients.

L’anàlisi de l’associació de genotips obtinguts amb probabilitats d’EFS va demostrar que els portadors de l’al·lel MRP3 A-189 (genotips AA i AT) havien reduït l’EFS en comparació amb individus amb genotip TT ( P = 0, 01, figura 2a). A causa del LD ( R 2 = 79%) entre els polimorfismes −1696 i −189 (figura 1b) es va associar una associació similar amb EFS per als portadors de l'al·lel MRP3 A-1696 ( P = 0.03, no mostrat). L'haplotip * 3 està etiquetat exclusivament per l'al·lel A-189 (A A CG), mentre que l'A-1696 es comparteix entre els haplotips MRP3 * 3 i l'haplotip menys comú * 5 ( A TCG) (figura 1b). D’acord amb això, es va notar la mateixa associació amb EFS per l’haplotip * 3. Una associació de MRP3 A-189 amb EFS es va mantenir significativa en l’anàlisi multivariant (ratio de perillositat = 2, 4, 95% de confiança = 1, 2–4, 7, P = 0, 01) amb la inclusió. de factors pronòstics clínics en el model. També es va mantenir significatiu després de controlar la taxa de descobriment fals al nivell 0, 05 pel nombre de polimorfismes provats ( q = 0, 03). Es va trobar una associació similar de l’al·lel A-189 amb supervivència lliure de malalties i supervivència global ( P = 0.02 i P = 0.05, respectivament, no mostrada). Una altra estratificació segons el tipus de recaiguda va revelar que l’al·lel A-189 proporcionava quatre vegades més gran risc de recaiguda SNC (proporció de risc univariada = 3, 7; interval de confiança del 95% = 1, 2-10, 9; P = 0, 01, figura 2a) i no es va veure afectat en anàlisi multivariant. La recidiva aïllada del SNC es va produir en vuit pacients i en cinc pacients addicionals va anar acompanyada d’una recaiguda de medul·la òssia.

Image

Associació de proteïnes relacionades amb la resistència a diversos medicaments (MRP) 3 Polimorfisme T A-189 T amb resultat de malaltia, toxicitat relacionada amb el tractament i nivells de metotrexat (MTX) en TOTS els pacients infantils. ( a ) Supervivència lliure de recaigudes (EFS, quadre esquerre) i sistema nerviós central (CNS) sense recaiguda (recaiguda del SNC, panell dret) segons els genotips. El nombre de pacients de cada corba que representen els pacients amb o sense al·lel MRP3 A-189, nombre d'individus amb un esdeveniment o una recaiguda del SNC (entre parèntesis), així com el valor P , estimat per la prova de classificació log per a la Les diferències de supervivència entre els grups de pacients estan indicades a cada parcel·la. A continuació, s’indica el risc d’esdeveniment associat al genotip donat, expressat en relació de risc univariable (HR) amb un interval de confiança del 95% (CI). ( b ). Freqüència de trombocitopènia i nivells de MTX en relació amb el polimorfisme MRP3 A-189 T. Freqüència mitjana de trombocitopènia ± error estàndard (quadre esquerre) i nivells mitjans de MTX (valors de μM, mesurats a 24 hores després de dosis altes (HD) -MTX) ± error estàndard per a individus amb i sense al·lel A-189 es donen a l'esquerra. i plafó dret, respectivament. El número d'individus representats per cada barra i el valor P obtingut per la prova de Mann – Whitney està indicat a la parcel·la.

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

Tenint en compte un risc més elevat d’esdeveniment associat a l’ al·lel MRP3 A-189, es podia haver estimat que també podria afectar els nivells de toxicitat i / o MTX relacionats amb MTX. Es va observar l’associació de significació límit ( P = 0.06) de l’al·lel A-189 amb l’ocurrència menys freqüent de trombocitopènia grau 2 (figura 2b). Com que les dades sobre la toxicitat només estaven disponibles per a 174 pacients, també es va analitzar una associació entre polimorfisme MRP3 -189 i EFS en aquest subgrup de pacients. L’associació es va mantenir significativa ( P = 0, 007, no mostrada). I finalment, els portadors de l’al·lel A-189 tenien nivells de MTX més alts de 24 h després de HD quan es comparaven amb pacients amb genotip TT (Figura 2b, P = 0.03) quan les anàlisis es limitaven només a pacients amb un esdeveniment. Aquest últim no es va mantenir significatiu després de la correcció de proves múltiples (pel nombre de paràmetres de toxicitat i nivells de MTX provats). No obstant això, tenint en compte la hipòtesi anterior sorgida de l'associació A-189 amb EFS inferior, aquestes anàlisis s'han de considerar més aviat com una confirmació addicional d'una associació observada inicialment amb l'EFS. A més, de manera similar als resultats obtinguts quan es va analitzar la correlació amb l'esdeveniment, es va notar l'ocurrència menys freqüent de trombocitopènia grau 2 ( P = 0, 04) i nivells de MTX més alts ( P = 0, 03) per als al·lots portadors A-1696 (no es mostra ) que comparteix el mateix haplotip que la variació A-189.

No es va obtenir associació entre els polimorfismes MRP restants i els nivells de toxicitat MTX / MTX després de la correcció de proves múltiples (pel nombre de polimorfismes i el nombre de resultats).

També es va realitzar un assaig de reporter gènic per definir la importància funcional de la variant del promotor MRP3 -189 i els haplotips derivats. L’activitat del promotor es va provar en tres línies cel·lulars diferents mitjançant la construcció del promotor d’1, 2 kb que abastava els llocs polimorfs de -189 i −140 (figura 2). L'anàlisi es va realitzar per a tres haplotips habituals amb al·lels TT, TC i AC, corresponents a la porció promotora dels haplotips MRP3 comuns (> 5%) MRP3 * 1, * 2 i * 3 (Figura 1b), respectivament. L’activitat superior es va observar per a l’haplotip * 2, en comparació amb l’haplotip * 1 ( P 0.01, figura 3). Haplotype * 3 va augmentar encara més l'activitat promotora a Hela i HepG2 ( P 0.01, Figura 3).

Image

Activitat relativa del promotor en relació amb la proteïna relacionada amb la resistència a diversos medicaments ( MRP ), haplotips promotors. L’activitat del promotor (mitjana ± sd) obtinguda pel test del reporter de la luciferasa per als haplotips MRP3 * 1, * 2 i * 3 es representen amb barres negres, gris clar i gris fosc, respectivament. El vector buit es representa amb la barra blanca. Els valors es donen per a tres línies cel·lulars diferents, Jeg-3, HeLa i HepG2. El valor P ( * si P 0.01 o ** si P <0, 0001) reflecteix la diferència en l’activitat del promotor entre l’haplotip * 2 i * 1 i entre l’haplotip * 3 i * 2.

Imatge a mida completa

  • Descarregueu la diapositiva de PowerPoint

Discussió

Es va identificar la variació del gen T MRP3 -promotor A-189 que pot afectar les respostes al tractament en la infància TOTS els pacients tractats segons els protocols DFCI. L’al·lel A va proporcionar un risc més gran d’esdeveniments en tots els pacients infantils, com es mostra en l’anàlisi univariada i multivariada. El mateix al·lel tendia a tenir menor presència de toxicitat, com es mostra a la menor freqüència de trombocitopènia de grau 2. Aquesta troballa seria d’acord amb el fenotip resistent al fàrmac que normalment es pensa que es produeix per un augment d’eflux i una disminució de l’acumulació cel·lular de fàrmacs anticancerígenes. La sobreexpressió de MRP3 s'ha demostrat que resulta en una alta resistència a la MTX en experiments d'exposició a curt termini a fàrmacs. 5, 9, 12 A més, els nivells més alts d’ARNm MRP3 en la infància ALL i els pacients amb leucèmia mieloide aguda van estar associats amb un pronòstic de malaltia significativament pitjor. 27, 28 De fet, el nostre assaig de reporters gènics va demostrar que l'haplotip marcat per l' al·lel MRP3 A-189 estava associat a l'activitat promotora superior.

Entre els pacients que han tingut un esdeveniment, l'al·lel A-189 també es va associar a majors nivells de plasma MTX 24 hores després de HD-MTX. Això pot suggerir una menor acumulació de fàrmacs intracel·lulars d'acord amb Kool et al. 12 van trobar que la quantitat total de MTX intracel·lular era menor a les cèl·lules que sobreexpressaven MRP3. Cal tenir present, però, que la depuració hepatobiliaria també pot afectar la concentració plasmàtica de MTX fins al punt que aquesta via té un paper en els humans (la recuperació de MTX a la bilis és inferior al 10% de la dosi després de l'administració intravenosa). 12, 29 De fet, els experiments recents amb ratolins de MRP3 van demostrar que les concentracions plasmàtiques de MTX eren significativament més baixes en els ratolins MRP3 - / - que en els ratolins de tipus salvatge causats per un major aclariment hepàtic i biliar. 29

Atesa la gran variabilitat interindividual en l'expressió MRP3, el contingut polimorf del gen MRP3 s'ha estudiat àmpliament en diferents poblacions. 30, 31 El focus es va centrar principalment en la substitució MRP3 C-211 T a causa de l'estudi inicial, que va trobar una expressió d'ARNm hepàtica inferior associada amb l'al·lel T. 31 La posició −211 es refereix al lloc d’inici de la traducció i correspon a −140 polimorfisme en el nostre estudi en què la posició es dóna respecte al lloc d’inici de la transcripció. Es va trobar l’al·lel T-211 (o T-140) que tenia una importància pronòstica adversa en pacients amb leucèmia mieloide aguda 32 i en càncer de pulmó. L'anàlisi funcional posterior no ha pogut confirmar, però, un canvi en l'activitat del gen reporter associada amb aquest polimorfisme T a la regió reguladora del gen humà ABCC3. Life Sci 2007; 80: 1490–1494. "Href = / articles / tpj201117 # ref34 aria-label =" Referència 34 "data-track = click data-track-label = link> 34 o nivells d'ARNm en pacients amb leucèmia aguda. T a la regió promotora. La proteïna 3 associada a la resistència multidroga (MRP3) no determina el nivell d’expressió del gen. Farmacogenet Genòmica 2006; 16: 149-150. " href = / articles / tpj201117 # ref35 aria-label = "Referència 35" data-track = clic data-track-label = link> 35 El nostre estudi no va revelar l'associació significativa d'aquest polimorfisme amb el resultat del tractament ni els nivells de MTX. No obstant això, el test reporter va mostrar l'activitat del promotor significativament inferior per a l'haplotip * 1 etiquetat per T-140 que confirma els resultats de Lang et al. 31 El C − 140 es troba present en els haplotips * 2 i * 3; l'haplotip * 3 es distingeix de l'haplotip * 2 per la presència d'un al·lel A-189, que sembla augmentar encara més l'activitat promotora, almenys en les línies cel·lulars. Lang et al. 31 no es va adonar de la influència del polimorfisme de -189 (posició -260 en el seu estudi) en els nivells d'ARNm hepàtics en individus sans, cosa que pot reflectir diferències específiques del teixit, menor mida de la mostra o diferències entre dades in vitro i in vivo .

Al gen MRP3 s'han identificat diversos polimorfismes no sinònims dels quals es va demostrar que algunes van tenir conseqüències funcionals. 30, 31 Tots, excepte Arg1297, el seu reemplaçament apareix amb la freqüència d'al·lel menor <2% i no es va examinar aquí.

L'anàlisi d'una associació de polimorfisme MRP3 -189 amb el tipus de recaiguda va demostrar que l' efecte MRP3 A-189 es limita majoritàriament a pacients amb recaiguda SNC. La teràpia usada per a la prevenció del SNC no sembla confondre aquesta associació. Sis pacients de 48 que eren portadors de l’al·lel A-189 tenien recaiguda per SNC (Figura 2a), dels quals 3 només van rebre quimioteràpia i 3 van rebre quimioteràpia amb CRT per a la prevenció de la recaiguda del SNC. Set pacients d'entre 190 sense al·lel A-189 tenien recaiguda per SNC; quatre pacients només van ser tractats amb quimioteràpia i tres van ser tractats amb tractament IT i CRT combinats. Es va informar anteriorment que la incidència de recaiguda del SNC en nois de SR va ser més alta en pacients que van ser tractats amb DFCI 87-01. 20 No hem pogut detectar una associació d’aquest tipus en l’anàlisi multivariada a causa del baix nombre de pacients amb recaiguda del SNC i dels tractats amb protocol DFCI 87-01 (cap dels pacients amb recaiguda SNC va ser atès amb aquest protocol). Es creu que els MRP semblants a la g-glicoproteïna poden limitar l’absorció de fàrmacs al SNC que actua a la barrera de líquid hematoencefàlic i cervell-sang. S'ha demostrat que en els tumors cerebrals s'ha mostrat una alta expressió de MRPs inclosos MRP3. 37, 38 Tot i que diversos estudis van confirmar l'expressió de MRP1 i MRP5 a la barrera hematoencefàlica o sang líquid cefalorraquidi, no es va proporcionar cap evidència clara de MRP2 i MRP3, 8, 39, 40, 41 fins fa poc quan Warren et al. La 42 mostraven una expressió moderada de MRP3 al cervell, amb un enriquiment mínim de quatre vegades a les cèl·lules capil·lars endotelials microvessel. Això indica que probablement l’expressió MRP3 té algun paper a l’hora de bloquejar les drogues per entrar al cervell. Si es confirma una associació d’ al·lel MRP3 A-189 amb recaiguda del SNC, podria tenir conseqüències importants per a l’ajustament inicial dels medicaments i la prevenció de la recaiguda del SNC.

S'han estudiat diversos polimorfismes en el gen MRP2 incloent la substitució de 5'UTR C – 24 T i les variacions no sinònimes G1249A, T3563A i G4544A que condueixen a substitucions d'aminoàcids Val417Ile, Val1188Glu i Cys1515Tyr, respectivament. El T-24 sembla conferir una disminució de l’expressió gènica, de l’activitat del gen reporter i de la capacitat de transport. 7, 43, 44 Es va associar l'associació d'aquest polimorfisme amb la depuració de l'àcid micofenòlic en els receptors d'al·lograft renals, l'hepatotoxicitat de diclofenac o la resposta a irinotecan en pacients amb càncer de pulmó no petit. 45, 46, 47 Rau et al. 48 van trobar que els nivells mitjans de MTX plasmàtics de 36 a 48 h després de la dosi alta de fàrmac eren significativament més elevats en totes les pacients femenines que portaven l’al·lel T-24. No hem trobat una associació així. La diferència en la dosi de MTX, el protocol de tractament o la població estudiada podria tenir en compte diferències observades suggerides que algunes de les troballes farmacogenètiques no es poden extrapolar necessàriament a altres protocols de tractament.

MRP2 Val417Ile es va associar amb un augment d'efluix intestinal i una disminució significativa de la biodisponibilitat del talinolol β-blocker, 44, 49 en línia amb l'observació d'una major toxicitat gastrointestinal de MTX en afroamericans tractats per artritis reumatoide. 50 Val1188Glu i Cys1515Tyr es van correlacionar amb l'expressió de l'ARNm més alta i la proteïna en el fetge 51 i amb cardiotoxicitat induïda per antraciclina en pacients amb limfoma no Hodgkin. No hem trobat associacions significatives d’aquests polimorfismes amb els punts d’objectiu estudiats en tots els nostres pacients.

Tot i que s’han identificat diversos polimorfismes en el gen MRP5 , hi ha 53 informacions menys sobre si aquests polimorfismes poden afectar la funció del gen o la seva resposta a la medicació. 15 Dazert et al. 54 no van trobar cap influència de la variació genètica de MRP5 en l'expressió d'ARNm MRP5 al cor humà. Sembla que el splicing alternatiu té un paper en la regulació de MRP5 mitjançant l'expressió d'una proteïna més petita, però potencialment funcional. No es va trobar cap associació entre polimorfismes MRP5 estudiats i TOTS els resultats en aquest estudi.

Com a conclusió, informem d’una associació de variant del promotor T MRP3 A-189 T amb els resultats de tractament en la infància TOTAL. L’al·lel A-189 es va correlacionar amb el resultat de la malaltia més pobra, la menor freqüència de trombocitopènia, l’augment de l’activitat promotora i els nivells més alts després de HD-MTX. Això suggereix una efluència MTX associada a A-189 i, per tant, una menor sensibilitat als medicaments. L’estudi proporciona informació addicional que augmentarà encara més el coneixement d’utilitzar les variacions genètiques d’hoste per adaptar la teràpia dels fàrmacs anti-leucèmia.