Les porphyromonas gingivalis gingipains causen una migració defectuosa dels macròfags cap a les cèl·lules apoptòtiques i inhibeixen la fagocitosi dels neutròfils apoptòtics primaris | mort i malaltia cel·lular

Les porphyromonas gingivalis gingipains causen una migració defectuosa dels macròfags cap a les cèl·lules apoptòtiques i inhibeixen la fagocitosi dels neutròfils apoptòtics primaris | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Infecció bacteriana
  • Migració cel·lular
  • Patogènesi
  • Periodontitis

Resum

La malaltia periodontal és una malaltia inflamatòria crònica freqüent caracteritzada per una resposta hoste aberrant a un biofilm de placa patògena que produeix danys als teixits locals i una curació frustrada que pot causar pèrdua dental. Les proteases de cisteïna (gingipaines) del patogen periodontal clau Porphyromonas gingivalis han estat implicades en la patogènesi de la malaltia periodontal mitjançant la inhibició de la resolució de la inflamació i estan relacionades amb afeccions inflamatòries cròniques sistèmiques com l'artritis reumatoide. El clearance eficient de les cèl·lules apoptòtiques és essencial per a la resolució de la inflamació i la restauració dels teixits. Aquí es va voler caracteritzar la depuració immunitària innata de les cèl·lules apoptòtiques i la seva modulació mitjançant gingipaines. Es va examinar la capacitat dels macròfags tractats amb gingipaina de migrar cap a les cèl·lules apoptòtiques i fagocitoses. El tractament amb la gingipaina de la lisina dels macròfags deteriora la migració dels macròfags cap als neutròfils apoptòtics. A més, el tractament amb la lisina amb gingipaina va reduir els nivells d’expressió superficial de CD14, un receptor clau de macròfags per a cèl·lules apoptòtiques, que va provocar una interacció reduïda de macròfags amb cèl·lules apoptòtiques. A més, mentre que les cèl·lules apoptòtiques i el seu secretoma derivat van demostrar que inhibien l'expressió induïda pel TNF- α per lipopolisacàrid de P. gingivalis , vam demostrar que els preparats de gingipaina indueixen una resposta inflamatòria ràpida en macròfags que era resistent als efectes antiinflamatoris de les cèl·lules apoptòtiques o el seu secretome. Agrupades, aquestes dades indiquen que P. gingivalis pot promoure la inflamació crònica vista en pacients amb malaltia periodontal mitjançant múltiples mecanismes, inclosa una inflamació ràpida i potent mediatitzada per gingipaina, unida a la clivada del receptor que comporta una eliminació defectuosa de les cèl·lules apoptòtiques i reduccions de respostes antiinflamatòries. . Així, les geningines representen un potencial objectiu terapèutic per a la seva intervenció en el tractament de la malaltia periodontal crònica.

Principal

L’homeòstasi estrictament regulada dels teixits és un procés fisiològic essencial, que es manté mitjançant un bon equilibri entre la proliferació cel·lular, la diferenciació cel·lular i la mort cel·lular. El procés d’apoptosi que es produeix durant una resposta inflamatòria suporta la resolució de la inflamació mitjançant la secreció de citocines antiinflamatòries i molècules resolutives que bloquegen la infiltració cel·lular inflamatòria i afavoreixen el reclutament de fagòcits que restableixen l’homeòstasi dels teixits. Els treballs recents demostren que diversos factors afavoreixen la eliminació de cèl·lules apoptòtiques (AC) i que aquests medien diferents etapes dins d’un complex procés multiestadi de la eliminació de cèl·lules apoptòtiques per vesícules extracel·lulars derivades de cèl·lules apoptòtiques i factors solubles (coneguts col·lectivament com a cèl·lula apoptòtica) secretome) pot promoure el reclutament de fagòcits a llocs de mort cel·lular amb els quals les interaccions lligam-receptor permeten lligar i engolir cadàvers de cèl·lules. 3, 4, 5, 6 El fracàs en qualsevol de les etapes de la liquidació de la CA pot conduir a malalties inflamatòries com a conseqüència de la necrosi secundària de l’AC, degut a l’alliberament d’antígens intracel·lulars i a l’estimulació immune. 7, 8, 9

A la cavitat oral, els teixits gingivals estan exposats a una àmplia gamma de microorganismes. L’evidència indica que l’apoptosi de teixit local impulsa la regulació de les reaccions immune-inflamatòries, que es produeixen en resposta a microbis que produeixen senyals antiinflamatoris que afecten els fagòcits al lloc de la infecció. 10 El control defectuós de la resposta inflamatòria en aquest microambient complex pot provocar una malaltia crònica i hiperinflamatòria de la periodontitis. En particular, Porphyromonas gingivalis s'ha associat amb la inducció i la propagació d'aquesta resposta hoste aberrant. 11 La resposta hiperinflamatòria no resolt produeix danys als teixits locals i, finalment, pèrdua dental. La malaltia també està associada a diverses malalties sistèmiques inflamatòries cròniques. Es considera que P. gingivalis deteriora la resposta inflamatòria de l’hoste, que fonamenta la patogènesi de la malaltia periodontal. 12, 13, 14

Una varietat de factors de virulència s’expressen per P. gingivalis , incloses les importants gingipaines cisteïnes-proteases, que poden ser específiques de l’arginina (RgpA i RgpB) o específiques de la lisina (Kgp). Els gingipains tenen un paper important en l’aparició de la inflamació mitjançant diversos mecanismes, incloent: la modificació del sistema del complement; activitat de la metaloproteinasa matriu; funció neutròfils; estructura i respostes vasculars del teixit periodontal; la xarxa de citocines hoste i els nivells de receptors de la superfície cel·lular. 15 Notablement, s'ha demostrat que les gengines van separar els receptors clau de reconeixement de patrons, 16 i 17, que han demostrat que medien el reconeixement i l'eliminació de la CA. 18 Els treballs anteriors també han demostrat que els productes de P. gingivalis poden modular la clearance de CA mitjançant múltiples canvis a la superfície de les cèl·lules apoptòtiques. A continuació, abordem la hipòtesi que les gingipaines promouen la progressió de la malaltia actuant per inhibir diverses etapes del procés d’aplicació de l’AC. Avaluem l'efecte de les genypaines sobre la capacitat dels macròfags d'identificar la CA, d'interactuar i d'eliminar AC i respondre per resoldre la inflamació. Per tant, aquest estudi proporciona una visió nova dels possibles mecanismes importants en la progressió de la periodontitis.

Resultats

Purificació i caracterització d’enzims proteolítics de P. gingivalis

Els experiments previs per aïllar gingipaines es van realitzar mitjançant dues soques de P. gingivalis (soques W83 i HG66). Els cultius es van fraccionar i es va valorar la presència de gingipaina mitjançant un assaig d’activitat de proteases a les membranes, el sobrenedant de cultiu i les fraccions de membrana externa (figures 1a i b). Aquests assajos van revelar que ambdues formes gingipaines (Rgp i Kgp) van ser alliberades en cultiu sobrenadant a quantitats actives significativament més elevades per la soca HG66 en comparació amb la soca W83 (Figura 1a). Posteriorment, els sobrenadants de cultiu de la soca HG66 es van utilitzar com a font tant de Rgp com de Kgp i es van purificar els enzims mitjançant la filtració en gel i la cromatografia per afinitat amb Sephadex G-150 i arginina-Sefarosa. Després de la purificació, es va confirmar l’activitat de la cisteïna proteasa mitjançant l’inhibidor específic TLCK, que és específic per a proteases similars a la tripsina com ara Kgp i Rgp (figura 1b). L’anàlisi de massa molecular (figura 1c) de les proteïnes purificades va indicar una sola banda major per a Kgp i una doble banda per a Rgp de massa molecular prevista de ≃ 60 kDa i ≃ 50 kDa, respectivament. 20, 21 Es va confirmar la purificació de gingipaines mitjançant anàlisi espectromètrica de masses (Taula suplementària 1). Es va valorar la contaminació per lipopolisacàrids (LPS) dins de les fraccions gingipaines purificades mitjançant el test Limulus Amoebocyys Lysate, que va confirmar la presència d’endotoxina als nivells de 2, 9 U / ml (RgpB) i 1, 9 U / ml (Kgp). Després de la purificació amb èxit de gingipaines, es va avaluar l’impacte d’aquests importants enzims derivats de patògens en l’eliminació d’AC.

Image

Determinació de l'activitat amidolítica i del pes molecular dels enzims proteolítics purificats de P. gingivalis . Les soques W83 o HG66 es van cultivar i es van fraccionar els cultius tal com es descriu. Es va valorar l’activitat enzimàtica amidolítica ( a ) per l’activitat de Rgp contra Bz-L-Arg-pNA (panell esquerre) i, per a l’activitat de Kgp, contra ZL-LYS-pNA (quadre dret) per a: extracte de cèl·lules unides a membrana (barra negra), sobrenedant de cultiu lliure de cèl·lules (barra blanca) i fraccions de membrana externa (barra grisa). Les proves estadístiques van comparar les diferències entre soques. Els enzims es van purificar mitjançant cromatografia. ( b ) Compara la inhibició del TLCK com a mesura de l'activitat de la cisteïna proteasa en les geningines purificades. ( c ) electroforesi SDS-PAGE de P. gingivalis HG66 purificat Rgp i Kgp gingipain. Les anàlisis estadístiques es van fer mitjançant ANOVA seguit de Bonferroni post- test * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Les dades mostrades són la mitjana ± SEM de tres experiments independents de cultius bacterians en fase log que es van cultivar durant 24 h (OD 600 nm)

Imatge a mida completa

Els gingipains redueixen l’expressió de CD14, un receptor d’aplicació de cèl·lules apoptòtiques

Una sèrie de receptors de fagocits han estat implicats en el reconeixement de l’AC i el CD14, un component immunitari important, s’ha identificat com a receptor clau de l’acceleració de l’AC. 22, 23 Els nostres estudis anteriors han demostrat que la línia cel·lular de monocits humans THP-1, quan es diferencia, proporciona un model eficaç per estudiar el paper dels macròfags (MØ) en el clearance de la CA i per avaluar el paper de les citocines i altres mediadors inflamatoris alliberats durant aquest procés. 5, 24, 25 Per comprendre l’impacte de les gingipaines en l’expressió de receptors de fagocits importants, es va examinar un quadre de receptors immuns innats sobre els fagocits abans i després del tractament amb gingipaines.

Les cèl·lules THP-1 tractades amb dihidroxivitamina D3 (VD3) es van utilitzar com a model fagocit, que expressa nivells elevats de CD14, que és funcional per a la depuració de l’AC. Es van tractar 5, 24 MØ o neutròfils humans primaris (NØ) amb RgpB o Kgp purificada i es va valorar l'expressió d'un panell de molècules (CD14, CD36, ICAM-3 i CD91) conegut per mediar la separació de CA mitjançant immunofluorescència indirecta i citometria de flux. (Figura 2a). Kgp va reduir específicament l'expressió de CD14, però no ICAM-3 o CD36, tant a la superfície de MØ com de NØ amb 1 h de tractament. Tot i això, mentre que Rgp també reduïa expressament la CD14 en NØ amb tractament de 1 h, es va requerir un període d’incubació allargat per veure la mateixa reducció en MØ (figura 2b), una reducció que no es va associar amb una pèrdua de viabilitat MØ (figura suplementària 1). A més, es va rescatar la ràpida reducció de CD14 vista en MØ tractat amb Kgp utilitzant l’inhibidor específic TLCK (figura 2c), cosa que suggereix que les gingipaines clivessin CD14. De manera crucial, aquest tractament amb gingipaina de MØ no va induir citotoxicitat detectable (figura 2d). Aquestes dades suggereixen que les gingipaines són capaces d’escindir específicament el receptor de lletatge de cèl·lules apoptòtiques CD14, dades d’acord amb informes anteriors. 16, 26, 27

Image

Gingipaines purificades retallen CD14 de la superfície dels macròfags i del NØ. ( a ) El NØ primari humà o el MØ derivat de cèl·lules THP-1 humanes es van tractar amb les gingipaines purificades indicades durant 1 h a 37 ° C abans de la tinció indirecta d’immunofluorescència per a receptors / lligands implicats en la depuració cel·lular apoptòtica. Els nivells de fluorescència es mostren com a percentatge de cèl·lules positives per a l’antigen (esquerra) i la intensitat de fluorescència mitjana (dreta). ( b ) MØ derivat de cèl·lules THP-1 es va tractar amb Rgp fins a 12 h a 37 ° C abans de la tinció indirecta d’immunofluorescència per a CD14 en els moments indicats. Els nivells de fluorescència es mostren com a percentatge de cèl·lules positives per a l’antigen i la intensitat mitjana de fluorescència. ( c ) MØ es va tractar amb Kgp durant 1 h en presència o absència de l'inhibidor TLCK abans de l'avaluació de l'expressió de CD14 mitjançant citometria de flux. ( d ) Anàlisis citomètriques de flux representatiu de MØ o NØ derivat de THP-1 tractades amb RgpB o Kgp durant 1 h a 37 ° C i tenyides amb annexina V i iòdur de propidi per revelar la viabilitat cel·lular. Les dades de flux mostrades es recopilen a partir d'almenys 5.000 esdeveniments. Les dades presentades són mitja ± SEM d'almenys tres experiments independents. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant ANOVA seguit d'un post- test Bonferroni. ** P <0, 01; *** P <0, 0001 en comparació amb cèl·lules no tractades

Imatge a mida completa

Els gingipains inhibeixen la migració direccional dels fagòcits cap a la CA

Com els resultats anteriors van demostrar la divisió específica i ràpida de CD14 per gingipains, posteriorment es va avaluar l’impacte d’aquest en la eliminació efectiva de l’AC. A continuació, es va avaluar l'impacte del tractament amb gingipaina tant en la migració de fagòcits cap a cèl·lules que moren com en l'eliminació de cadàvers cel·lulars.

Per considerar l'efecte de les gingipaines en la migració de MØ, THP-1 MØ es va tractar inicialment amb Kgp, ja que actua ràpidament sobre els receptors MØ (Figura 2a) i després es van exposar a cultius AC (primàries NØ o limfoma de Burkitt (BL)) en una horitzontal. Sistema de cambres de quimiotaxi Dunn. Anteriorment, hem demostrat que les cèl·lules BL apoptòtiques serveixen com a model rellevant per estudiar la unió i captació dels fagòcits 5, 22 i, per tant, s'utilitzaven com a control positiu. La migració de fagòcits es va registrar durant 2 h a 37 ° C mitjançant microscòpia de vídeo en lapse de temps (figura 3). Els fagòcits eren clarament mòbils durant tot el període d’assaig, fins i tot en absència d’un atractiu putatiu (plafó esquerre, figures 3a i c). No obstant això, quan els fagòcits van estar exposats a NØ apoptòtic (panell mitjà, figura 3a) o a cèl·lules B apoptòtiques (panell mitjà, figura 3c), es va fer evident un moviment ràpid i direccional de MØ. Tanmateix, la MØ tractada amb Kgp va continuar migrant, però, la migració del fagocit tractat amb gingipaina cap a la CA es va reduir significativament (plafó dret, figures 3a i c). Això ho va demostrar un índex de migració reduït cap endavant tant per a cèl·lules BL apoptòtiques com per NØ apoptòtic primari en comparació amb la migració de MØ no tractada cap a la CA (Figures 3b i d). És important destacar que no es van afectar altres mesures de migració (concretament la velocitat, la distància acumulada i la distància euclidiana) (figura suplementària 2). Així, el tractament de MØ amb Kgp, va reduir significativament només la direccionalitat de la migració de MØ cap a cèl·lules que moren, afectant efectivament el reclutament de MØ a les cèl·lules que moren. Altres estudis van utilitzar un sistema de migració vertical per abordar la migració posterior amb MØ després del tractament amb gingipaina. Aquests estudis demostren que el tractament Rgp també inhibeix la migració de MØ a NØ apoptòtic (Figura 3e).

Image

Els gingipains inhibeixen la migració dels macròfags cap a l’AC. MØ derivat de cèl·lules THP-1 van ser exposades a atractius putatius en un assaig de migració horitzontal o vertical. Per a l’assaig horitzontal ( a - d ), es van sembrar MØ a copes de vidre i es van tractar o no tractar amb geniveres abans de carregar-les a una cambra horitzontal de Dunn i exposar-se a atractius putatius ( a - d ). La migració de MØ es va controlar durant 2 h a 37 ° C mitjançant microscòpia de vídeo en lapse de temps. La migració de 40 cèl·lules per assaig es va mesurar mitjançant ImageJ i Ibidi Chemotaxis i Migration Tool (V2.0). La ruta de desplaçament MØ es mostra mitjançant una línia des del punt de partida (establert als pèls creuats de les parcel·les) fins a la posició MØ final després de 2 h (punt negre). La ubicació relativa de CA estava a la part superior de la trama (diamant negre). ( a ) Parcel·les representatives que mostren: panell esquerre: migració MØ (MØ) no tractada amb control, sense medi cel·lular com atractiu putatiu per revelar els nivells basals de la migració MØ. Tauler central: migració de MØ no tractat (MØ) amb NØ apoptòtic com a atractiu. Panell dret: migració de MØ (Kgp-MØ) tractada amb Kgp amb NØ apoptòtic com a atractiu. ( b ) Índex de migració cap endavant (Y FMI) per quantificar la migració MØ en direcció al gradient putatiu. ( c ) Parcel·les representatives que mostren: panell esquerre: migració MØ (MØ) sense tractament amb control, sense medi cel·lular com atractiu putatiu per revelar nivells basals de migració MØ. Tauler central: migració de MØ no tractada (MØ) amb cèl·lules B apoptòtiques com a atractiu. Panell dret: migració de MØ (Kgp-MØ) tractada amb Kgp amb cèl·lules B apoptòtiques com a atractiu. ( d ) Índex de migració cap endavant (Y FMI) per quantificar la migració MØ en direcció al gradient putatiu. ( e ) Per al assaig de migració vertical, es va sembrar MØ (no tractat o tractat amb gingipaina) a un vaixell per sobre d’un pou inferior que conté secretoma des de migració apòptica NØ i MØ a cambra inferior avaluada després de 10 h mitjançant el recompte de cèl·lules. Les dades mostrades a ( b i d ) són representatives de quatre experiments diferents amb dues rèpliques a cada experiment. L’anàlisi estadística es va realitzar mitjançant ANOVA seguit de Bonferroni post- test * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001

Imatge a mida completa

Els gingipains inhibeixen la interacció d’AC amb MØ

L’eliminació ineficient del NØ apoptòtic pot provocar danys importants en el teixit periodontal si no se’ls elimina ràpidament per MØ. 28

Un treball anterior ha demostrat la importància del CD14 com a receptor de lligadura per a l’AC mitjançant l’ús d’animals 22, 23 o CD14 anti-CD14 anti-CD14. 29 Aquests estudis demostren que MØ CD14 s'uneix a lligams encara no identificats a la superfície d'un ampli ventall de CA. Atesa la reducció mediada per la gingipaina en l’expressió de CD14 (Figura 2), es va avaluar l’impacte del tractament amb gingipaina en l’eliminació de l’AC. El THM-1 MØ es co-cultivava amb AC (BL o NØ) i el nivell d’interacció AC-MØ es va anotar i es va comparar amb el d’equivalent tractat amb gingipaina MØ. La fotomicroscòpia va revelar evidència de MØ que interaccionava amb AC (figura 4a), on la "interacció" es defineix com a unió d’enllaç o fagocitada, independentment del nombre d’AC lligat o interioritzat. Quan es va anotar aquest nivell d’interacció, va quedar clar que el percentatge de MØ que interaccionava amb cèl·lules NØ apoptòtiques es va reduir significativament després del tractament amb gingipaina amb MØ (panell esquerre, figura 4b). Aquest efecte va ser més evident quan es va anotar el nombre mitjà d’AC per MØ (plafó dret, figura 4b). Tanmateix, quan es van utilitzar cèl·lules BL apoptòtiques, les gingipaines no van provocar una disminució de la interacció (plafó esquerre, figura 4c), conseqüència del seu fracàs en inhibir completament la interacció de cèl·lules BL apoptòtiques amb MØ. Tanmateix, es va notar un clar efecte inhibidor de la gingipaina quan es va anotar el nombre mitjà d’AC per MØ (panell dret, figura 4c). En aquests assajos, ambdues gingipaines van analitzar la reducció de la reducció de l’AC que indica que aquest efecte no es media només a través de l’expressió reduïda de CD14, ja que, en aquest període de temps, només Kgp reduïa els nivells de MØ CD14. És important destacar que el tractament amb gingipaina no va tenir cap efecte significatiu en la viabilitat de MØ (figura suplementària 1).

Image

El tractament amb gingipaina de MØ inhibeix la interacció de MØ amb NØ apoptòtic i cèl·lules BL apoptòtiques. El MØ derivat de THP-1 es va tractar o no tractar amb geningipaines abans del co-cultiu amb AC durant 1 h. ( a ) Fotomicrografies de MØ no derivades de cèl·lules THP-1 tractades o tractades amb gingipaina de Jenner – Giemsa que interaccionen amb cèl·lules BL apoptòtiques (AC BL) o NØN apoptòtic primari (AC NØ). No tractat THP-1 MØ que mostra lligadura i fagocitosi de BL apoptòtic (panell superior esquerre) i NØ (quadre inferior esquerre). THP-1 MØ tractat amb gingipaina (Rgp: panells centrals; Kgp: panells a la dreta) mostrant interacció amb menys cèl·lules BL apoptòtiques (panells superiors) i NØ (panells inferiors) amb un nombre augmentat d’AC extracel·lulars no vinculades / no fagocitoses (fletxes) ). THP-1 MØ es pot veure en blau clar i en color AC un tac intens intens característic. Les fletxes del plafó inferior dret indiquen NØ apoptòtic primari que no són agafades per fagòcits. Totes les imatges es van prendre amb una ampliació × 40. ( b ) Histogrames que mostren el percentatge de MØ interaccionant (enquadernació o fagocitosi) amb cèl·lules NØ apoptòtiques (panell esquerre) o el nombre mitjà de CA per MØ (panell dret) amb o sense tractament amb gingipaina de MØ o ( c ) histogrames que mostren el percentatge de MØ interaccionant (enquadernació o fagocitosi) amb cèl·lules BL apoptòtiques (panell esquerre) o el nombre mitjà d’AC per MØ (panell dret) amb o sense tractament amb gingipaina amb MØ. Les dades mostrades són mitja ± SEM d'almenys tres experiments independents. L’anàlisi estadística es va realitzar mitjançant ANOVA seguit de Bonferroni post- test: *** P <0, 001

Imatge a mida completa

La producció de TNF- α per MØ en resposta a P. gingivalis LPS és inhibida per l’AC o els seus secretomes derivats

El líquid de l’AC és conegut pel seu fenotip no flogístic i l’AC ha exercit àmpliament efectes antiinflamatoris per afavorir la resolució de la inflamació. 30, 31, 32 Per explorar la naturalesa de les respostes inflamatòries de MØ en presència d’AC, es va valorar la producció de MØ de TNF- α en resposta a LPS de P. gingivalis en presència o absència de cèl·lules BL Nop apoptòtiques o apoptòtiques. A més, es coneix que l’AC deixa alliberar una varietat de factors (el secretoma), inclosos els vesícules extracel·lulars derivats de les cèl·lules apoptòtiques, al seu sobrenedant que pot modular la clínica cel·lular apoptòtica. 3, 5, 6, 33 P. gingivalis LPS va ser capaç d’induir una forta producció de TNF- α que va ser inhibida després de la incubació de MØ amb AC o el seu secretoma derivat (Figura 5a). Això suggereix que és possible que l’AC pugui exercir un efecte antiinflamatori dominant sobre la producció de TNF- α induïda pel patogen P. gingivalis .

Image

El NØ apoptòtic inhibeix el LPS induït per LPS, però no produït per TNF- α induït per la gingipaina ( a ) MØ (VD3 / PMA) derivat de THP-1 es va co-cultivar amb AC (NØ o BL) o els seus secretomes derivats durant 18 h abans de la addició de LPS de P. gingivalis . Després d'estimulació de 4 h, es va avaluar la producció de TNF- α mitjançant ELISA. ( b ) MØ derivat de THP-1 (negre: THP-1 diferenciat de VD3; gris: THP-1 diferenciat per VD3 / PMA) es van tractar amb la gingipaina indicada durant 1 h immediatament abans de ELISA per a TNF- α produït. ( c ) El MØ derivat de THP-1 (VD3 / PMA) va ser co-cultivat amb AC (NØ o BL) o els seus secretomes derivats durant 18 h abans de tractar-se amb gingipaina de P. gingivalis a ELISA per a TNF- α produït. Les dades mostrades són mitjanes ± SEM per a tres experiments independents. L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant ANOVA seguit de Bonferroni post- test: ** P <0, 01, *** P <0, 001

Imatge a mida completa

Les gingipaines indueixen la producció de TNF- α per MØ que no sigui inhibida per l’AC

Quan es van considerar els efectes de les gengines en la capacitat de l’AC de modular la inflamació, vam observar que el tractament amb gingipaina només amb MØ era suficient per induir la producció de TNF- α en només 1 h (figura 5b). Aquest efecte es va observar amb dos models diferents de MØ derivat de THP-1 (VD3 o PMA / VD3) que se sap que tenen una sensibilitat profundament diferent a la LPS (figura suplementària 3). 24 Notablement, les respostes d’aquestes cèl·lules als preparats de gingipaina van ser similars, cosa que indica que la resposta inflamatòria detectada no es va deure a la contaminació per LPS de preparacions de gingipaina. Aquesta observació planteja la possibilitat que la inflamació crònica es pugui derivar de l’acció directa de les gengines contra les respostes proinflamatòries i no simplement per efectes indirectes (per exemple, mitjançant l’eliminació d’AC inhibida).

Tenint en compte aquesta inducció intrínseca de la inflamació, ens interessava considerar la capacitat de l’AC o el seu secretoma derivat de modular aquesta resposta. D'acord amb els experiments anteriors (Figura 5a), es van tractar MØ amb AC o secretoma abans de l'addició de l'estimulant inflamatori (Rgp o Kgp) i l'anàlisi de la producció de TNF- α . Tot i que l’AC o el seu secretoma derivat van inhibir la producció de TNF- α induïda per LPS (Figura 5a), aquestes cèl·lules o els seus secretomes no tenien cap capacitat de reduir la inflamació induïda per la gingipaina (Figura 5c). Aquestes dades plantegen la possibilitat que les gingipaines indueixin una inflamació del teixit local resistent als mecanismes habituals que pretenen afavorir la resolució de la inflamació.

En conjunt, les dades aquí presentades donen suport a la idea que el patogen gingival clau P. gingivalis promou la inflamació mitjançant diferents mecanismes. Aquests inclouen la inhibició de la depuració de les cèl·lules apoptòtiques mitjançant l’acció de gingipaines sobre mecanismes d’aplicació de cèl·lules apoptòtiques incloent CD14 i mitjançant la inducció directa de la inflamació gingipaina que es recalcitrant als efectes inhibidors habituals de l’apoptosi.

Discussió

Estudis anteriors han demostrat que un factor important en la malaltia periodontal és la important activitat proteolítica de P. gingivalis inclosos els tres productes gènics que codifiquen les geningines. 26, 34, 35 En el present estudi, caracteritzem dos genypapa (Kgp i Rgp) per la seva capacitat de modular un esdeveniment clau en la resolució de la inflamació, és a dir, per la ràpida eliminació de l’AC. Per primera vegada, adoptem un enfocament més complet de l’anàlisi in vitro de la depuració de l’AC i considerem l’impacte de les geningines no només en la unió i la fagocitosi de l’AC, sinó també en la migració dels fagocits cap als cadàvers cel·lulars i la seva modulació immunològica morint. cèl · lules. La migració dels fagòcits cap a la CA és un esdeveniment clau en el procés de depuració que sovint es passa per alt en assajos in vitro d’eliminació de l’AC.

Aquí informem de l’aïllament de Kgp i Rgp de P. gingivalis mitjançant mètodes establerts. Les nostres anàlisis de l’activitat de la proteasa són consistents amb l’aïllament amb èxit en línia amb treballs anteriors. 20, 21, 34, 36

La malaltia periodontal és una malaltia inflamatòria crònica, no resolutiva, caracteritzada per una activitat neutròfila persistent. Durant la inflamació aguda, el reclutament de neutròfils és seguit per apoptosi de neutròfils i una ràpida eliminació no flogística d’AC per MØ. El curs de la liquidació de l’AC és un procés complex i multiestadi que comença amb l’AC comunicant la seva presència a través del seu secretoma (és a dir, vesícules extracel·lulars derivades de cèl·lules apoptòtiques i factors solubles), que actuen com a senyals de “trobar-me” als fagòcits (revisat a la referència. 37). Després del reclutament de fagocits, una sèrie de lligands, receptors i molècules de pont afecten l'efecte de la unió i eliminació dels cadàvers cel·lulars (revisat a la referència 37). A més, la modulació immune del microambient admet efectes de resolució pro i antiinflamatoris. 38 Tenint en compte la importància de l’aprofitament de la CA per al control de la inflamació, es va intentar definir l’impacte de les gengines en aquests processos per entendre millor els defectes que poden contribuir a la malaltia periodontal.

El reclutament de fagòcits a llocs de mort cel·lular és un procés essencial per promoure la resolució efectiva de la inflamació. Aquí mostrem que els MØ tractats amb gingipaines són menys directes en la seva migració cap a cèl·lules que moren. Tot i que les nostres dades suggereixen una correlació entre la pèrdua de CD14 i la migració inhibida després del tractament amb proteases, aquesta no identifica formalment una relació causal. De fet, Rgp va inhibir profundament la migració de MØ en els moments en què la divisió de CD14 era baixa. Així doncs, el mecanisme molecular precis amb què s’efectua aquesta inhibició mediada per gingipaina continua sent completament diluït, no obstant això, segueix sent una possibilitat que es mediagi mitjançant CD14. El treball anterior 33 suggereix que el CD14 no és necessari per detectar cèl·lules que moren, encara que l'estudi no va valorar la direccionalitat com es va estudiar aquí. A més, mereixen molta atenció els recents informes sobre la migració de leucòcits 39 i 40 mediada per CD14. Es requereixen estudis addicionals per definir mecanismes alternatius d’acció, possiblement mediatitzats a través de receptors de quimiocines GPCR, per exemple, les proteïnes de P. gingivalis trenquen el receptor C5a humà. 41 Així, CX 3 CR 1, que promou la migració a la CA, o la divisió de receptors per factors secretom (per exemple, vesícules extracel·lulars derivades de cèl·lules apoptòtiques) que també promouen la migració 3, 5, 6, 33 poden ser objectius possibles per a gengines. Independentment del mecanisme, és probable que qualsevol reducció de la migració direccional afecti el curs de la inflamació en la periodontitis. També pot ser un mecanisme mitjançant el qual es produeixin efectes sistèmics de geningipains, amb un recrutament de MØ mal controlat a tot el cos.

A continuació, es demostra que els Gingipains s'articulaven MØ CD14 d'acord amb estudis anteriors. 16, 26 El tractament només amb LPS no va tenir aquest efecte. Demostrem que Kgp clava CD14 més ràpidament que Rgp, d’acord amb observacions anteriors d’activitat relativa de gengines. 42 Això pot ser degut a la presència d’un domini d’hemagglutinina / adhesió present a Kgp però no a RgpB. Les nostres dades es correlacionen amb investigacions clíniques anteriors que reporten menys expressió de CD14 en mostres de periodontitis crònica que en mostres gingivals periodontals sanes, donant suport a la idea que l’expressió CD14 es correlaciona amb la salut periodontal. 43 Aquesta ruptura en un període aproximat d’1 h de l’exposició a la proteasa augmenta el potencial d’aparició ràpida d’efectes perjudicials associats a la pèrdua de CD14. A més, és molt probable que es puguin escindir altres receptors encara que no hem detectat cap reducció de ICAM-3, CD36 o CD91. Això és sorprenent, donada la presència de llocs de clivatge de gingipaina putativa dins de les seqüències de proteïnes, però destaca que l’accessibilitat de llocs de clivatge pot ser clau per determinar si es pot escindir un objectiu molecular determinat. Curiosament, demostrem també que es discreta el neutròfil CD14, cosa que suggereix que els lligands en leucòcits moribunds poden estar afectats en el microambient periodontal. Un treball anterior suggereix que la pèrdua del CD31 de NØ tractat amb Rgp, però no de Kgp, pot afavorir la eliminació de NØ per MØ. Tot i que es demostra la ruptura de CD14, és probable que també es tallin altres lligands / receptors i es valgui una valoració completa de totes les dianes moleculars.

Els mecanismes per eliminar les cèl·lules moribunds presenten un alt nivell de redundància. Tanmateix, el CD14 és un receptor clau de l’atacat per a l’AC 22 que no és redundant ja que els animals amb deficiència de CD14 porten un augment de cadàvers de cèl·lules persistents. Curiosament, Truman et al. 33 van suggerir que es podia regular el MØ CD14 durant la migració cap a la CA, ja que són cada vegada més competents per eliminar els cadàvers cel·lulars. En conjunt, sembla probable que la ràpida escisió de CD14 i el consegüent fracàs d'una depuració eficient de CA promoguin un control defectuós de la inflamació en la periodontitis. La persistència cel·lular de NØ hiperactiu a partir del greix gingival dels pacients amb periodontitis causarà danys col·laterals als teixits 45 i l’eliminació fallida del NØ activat pot causar la destrucció del teixit ja que sofreixen necrosi, provocant danys del teixit periodontal. 28 La nostra investigació es correlaciona també amb estudis anteriors que van posar de relleu el nivell de mort de cèl·lules necrotiques, probablement com a conseqüència de la fallada de la depuració, en NØ; 46, 47, a més del seu alliberament d'enzims hidrolítics destructius 48, 49, 50 que es troben en el líquid crevicular gingival de la fase activa de la periodontitis. Aquests donen suport a la idea que el fet de no absorbir el NØ apoptòtic després de la ruptura de la gingipaina de receptors específics, per exemple, CD14, impulsarà la necrosi que es tradueix en la destrucció de la matriu de teixit connectiu en la periodontitis.

També cal destacar que estudis anteriors també han demostrat que la divisió de CD14, mitjançant l'elastasa neutròfila humana, pot inhibir la depuració de l'AC 51, tot i que era el potencial per a la inhibició de la proteasa, mitjançant el lliurament d'inhibidors, per recuperar la CA efectiva que proporciona una clara ració terapèutica dins. malaltia periodontal. A més, aquest treball anterior posa en evidència la probabilitat de la ruptura de CD14 en la funció cel·lular de fagocits.

L’equilibri de les respostes cel·lulars proinflamatòries i pro-resolució / antiinflamatòries decidirà la naturalesa i la durada d’una resposta inflamatòria en el teixit. Està ben establert que l’AC exerceix efectes antiinflamatoris forts 30, 31 i que l’aparició de la inflamació inicia esdeveniments que finalment promouen la resolució. 38 Aquí es va valorar la capacitat del NØ humà apoptòtic humà i del seu secretoma derivat per inhibir la inflamació induïda per LPS de P. gingivalis . D'acord amb els informes anteriors que utilitzaven E. coli LPS, 24, 30, 31, 32, es va observar un fort efecte antiinflamatori que suggereix que les cèl·lules que moren, dins d'un periodonti infectat amb P. gingivalis , haurien de ser capaços de promoure la resolució de la inflamació. However, we noted that gingipain treatment of MØ alone was sufficient to induce inflammatory responses. Recently, gingipains have been reported to promote monocyte inflammatory responses 52 via protease-activated receptors and Toll-like receptors/NOD-like receptor ligation. 53 Furthermore, gingipains have been shown to cleave protease-activated receptors on oral keratinocytes resulting in innate immune responses. 54 Kgp is capable of generating a keratin fragment from epithelial cells, which induces inflammatory responses in epithelial and fibroblast cells. 55 Importantly, this gingipain-induced inflammation was not modulated by AC suggesting that gingipain-induced inflammation may be dominant within the periodontal microenvironment, possibly as a result of loss of key immune modulatory receptors and/or induction of potent inflammatory responses. This may be responsible for driving a continued inflammatory response.

Although our study has focused on the impact of gingipains on the sensing and handling of dying leukocytes, it is important to note that CD14 is an innate immune receptor and the modulation of CD14, and other such receptors, by gingipains is likely an immune evasion strategy of the pathogen. 16 Thus, when considering the complete periodontal environment, one should also assess the impact of gingipain treatment on phagocyte migration towards P. gingivalis and subsequent immune clearance.

Taken together, we propose that gingipains can have profound and varied effects on the resolution of inflammation. The inhibition in directional migration of MØ towards dying cells, coupled with reduced efficiency of apoptotic cell clearance and induction of dominant pro-inflammatory responses by gingipains, will promote the chronic inflammatory milieu characteristic of the progressive and debilitating periodontal disease. Thus, we support gingipains as an attractive target for therapeutic intervention.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

    La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)