El cribratge proteòmic identifica la calreticulina com un objectiu directe mir-27a que repressió de l'exposició superficial de cèl·lules i MHC de classe I en càncer colorectal | mort i malaltia cel·lular

El cribratge proteòmic identifica la calreticulina com un objectiu directe mir-27a que repressió de l'exposició superficial de cèl·lules i MHC de classe I en càncer colorectal | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Càncer de colon
  • miRNAs

Resum

El deteriorament de la resposta immune i l'expressió aberrant dels microRNA són distintius emergents de la iniciació / progressió del tumor, a més de mutacions del gen conductor i modificacions epigenètiques. Vam realitzar una enquesta preliminar sobre conjunts de dades de miRnoma independent d’adenoma i càncer colorectal (CRC) i, entre els miRNAs més desregulats, vam seleccionar miR-27a i vam revelar que ja està regulat en l’adenoma i augmenta encara més durant l’evolució a l’adenocarcinoma. Per identificar nous gens i rutes regulades per aquest miRNA, es va utilitzar una anàlisi diferencial de proteomes 2DE-DIGE. Vam demostrar que miR-27a modula un grup de proteïnes implicades en l'exposició superficial cel·lular de classe I de MHC i, de forma mecànica, va demostrar que la calreticulina és un objectiu directe miR-27a responsable de la majoria d'efectes aigües baixes en experiments d'epistasi. La miR-27a in vitro va afectar la proliferació cel·lular i l’angiogènesi; Els xenografts de ratolí de les línies cel·lulars de CRC humanes que expressen diferents nivells de miR-27a van confirmar les variacions de proteïnes i van recapitular els efectes del creixement cel·lular i de l’apoptosi. MiR-27a in vivo correlacionada inversament amb molècules de classe I de MHC i expressió de calreticulina, infiltració de cèl·lules T CD8 + i activitat citotòxica (exposició a LAMP-1 i alliberament de perforina). Els tumors amb alta miR-27a, baixa calreticulina i infiltració de cèl·lules T CD8 + es van associar amb metàstasi llunyana i mal pronòstic. Les nostres dades demostren que miR-27a actua com un oncomiRNA, reprimeix l'expressió MHC de classe I mitjançant la reducció de la calreticulina i afecta la progressió del tumor. Aquests resultats poden obrir el camí per a un millor diagnòstic, estratificació del pacient i nous enfocaments terapèutics.

Principal

El càncer colorrectal (CRC) és la tercera causa principal de càncer a tot el món. 1, 2 A més de les mutacions gèniques i les modificacions epigenètiques, la deterioració de la resposta immune i la desregulació de microRNA són distintius emergents de la iniciació / progressió del tumor. 3, 4, 5 cèl·lules tumorals generen una resposta immune nativa i adaptativa mediada per diferents tipus de cèl·lules destinades a eradicar el tumor. 6 El processament i presentació d'antígens mitjançant molècules de classe I complexes d'histocompatibilitat important (MHC) és un esdeveniment crític per a realitzar una resposta antitumoral específica. 7 Els pèptids antigènics de classe I s’originen a partir de la degradació de proteïnes intracel·lulars mediada per proteasoma i es transporten al reticle endoplasmàtic a través dels transportadors associats a proteïnes de processament d’antigen (TAP1 i 2). Aquí es carreguen al complex de càrrega de pèptids (PLC) format per GRP78, calnexina i tapasina en la qual es recluta calreticulina i ERp57 per interactuar amb molècules de classe I de MHC. 8, 9 Un cop carregades amb antígens 'òptims', aquestes últimes molècules es dissocien del PLC i es traslladen a la superfície cel·lular on són reconegudes per les cèl·lules del sistema immune, contribuint a la vigilància immune. 9, 10, 11

Els defectes de la presentació d’antígens de classe I MHC es produeixen a alta freqüència en tumors sòlids i és una característica de l’evasió immune del tumor que fa que les cèl·lules canceroses siguin invisibles a les cèl·lules T citotòxiques. Una pèrdua selectiva o un nivell reduït de MHC classe I s’associa generalment amb la progressió de la malaltia i la reducció de la supervivència del pacient. Concretament, la detecció de la classe I de MHC es detecta a> 74% dels tumors colorectals i associada amb una supervivència significativa més específica de la malaltia mitjana en comparació amb els tumors que expressen alta classe MHC. 6, 12

La desregulació de microRNAs és una característica comuna de les malalties malignes humanes, ja que actuen com oncomiRNAs o miRNAs supressors del tumor. 4, 5, 13 La contribució dels miRNAs a la resposta immune antitumoral encara no està definida i és un tema intensament investigat. En aquest estudi, vam realitzar una enquesta preliminar sobre conjunts de dades d’adenoma independent i miRnoma de CRC i, entre els miRNAs més desregulats, vam seleccionar miR-27a i vam demostrar que ja està regulat en l’adenoma i augmenta encara més durant l’evolució a l’adenocarcinoma. Posteriorment, mitjançant un enfocament proteòmic, es van identificar una sèrie de proteïnes noves modulades per miR-27a que estan implicades en l’exposició superficial cel·lular de classe I de MHC. En experiments amb guanys i pèrdues de funció, proporcionem proves que miR-27a deteriora aquesta via dirigida directament a la calreticulina. A més, miR-27a afecta molt la proliferació cel·lular i l’angiogènesi in vitro i en xenografts de ratolí on es recapitulen aquests resultats. Consistentment, el miR-27a està sobreexpressat en una gran proporció de CRC esporàdics humans, es correlaciona inversament amb les molècules de classe I de MHC i la calreticulina i la infiltració i activitat de les cèl·lules T CD8 + . La combinació de miR-27a alta / calreticulina baixa està associada a metàstasi llunyana i pitjor resultat.

Resultats

El miR-27a està regulat en l’adenoma humà i la CRC

Hem analitzat de manera preliminar un conjunt de dades d’adenoma a disposició pública per al perfil d’expressió de miRNA (E-MTAB-813); 14 el full de calor informa la llista dels que estan regulats o regulats per baix. També es van analitzar dos conjunts de dades independents de miRnoma de CRC (GSE35602_microarray i TCGA_miRNA-seq) 15, 16 i, en interseccionar els resultats com es mostra al diagrama de Venn, es van identificar tres miRNAs regulats comuns (Figures 1A – C). Es va seleccionar miR-27a per a una anàlisi més avançada i es va valorar la seva expressió a la nostra sèrie d’adenomes ( n = 32) i CRC esporàdics ( n = 80) mitjançant l’anàlisi quantitativa RT-PCR. miR-27a ja va ser elevada en prop del 60% d’adenomes i va augmentar encara més durant la progressió del tumor (estadis I – II, n = 48; estadis III – IV, n = 32), cosa que suggereix que la seva expressió aberrant és un esdeveniment precoç en la tumourigenesi del còlon. (Figura 1D). Aquestes dades es van confirmar mitjançant una hibridació in situ que va mostrar nivells elevats en adenomes que van augmentar en mostres de tumor diferenciades i encara més en les mostres de tumors no diferenciats (Figura 1E).

Image

La regulació de mir-27a es reconeix en silico i es confirma en l’adenoma i l’anàlisi del teixit CRC. ( A ) El full de calor mostra el microRNA expressat de manera diferent en una sèrie de teixits d’adenoma ( n = 21) respecte a la mucosa normal (E-MTAB-813). 14 La fletxa vermella indica alts nivells de miR-27a en mostres d’adenoma. ( B ) Els miRNAs expressats de manera diferenciada en 13 mostres de CRC epitelials i quatre teixits normals (GSE35602) es visualitzen a la trama del Volcà (quadrats vermells; canvi de plecs> 2, P ≤0, 05); Es fletxa 15 miR-27a (quadrat verd). Les línies verdes indiquen els llindars de canvi de plec i valor P. ( C ) El diagrama de Venn mostra el nombre de miRNA expressats de manera diferenciada identificats en conjunts de dades CRC independents i disponibles públicament analitzats per microarray (blau; GSE35602) 15 o RNA-seq (groc; conjunt de dades TCGA COAD). 16 Només s’indiquen a la taula de sota el diagrama els miRNA compartits i els seus nivells d’expressió relativa. Canvi de plecs> 1, 5; P <0, 01. ( D ) El quadre del quadre mostra els nivells de miR-27a avaluats mitjançant la transcriptasa inversa-PCR quantitativa en els nostres teixits normals, adenomes ( n = 32) i mostres de CRC ( n = 80) classificats segons estadis tumorals (estadis I – II, n = 48; etapes III – IV, n = 32). ( E ) Hibridació representativa in situ (ISH) de miR-27a en diferents etapes de la tumourigenesi colorectal (ampliacions originals × 10 i × 5)

Imatge a mida completa

Identificació de nous gens i rutes regulades per miR-27a mitjançant anàlisi de proteomes diferencials

Per identificar proteïnes i rutes noves modulades per miR-27a, es va utilitzar un enfocament proteòmic. Primer es va valorar la seva expressió en una sèrie de línies cel·lulars derivades de CRC i es va seleccionar HCT116 entre les que sobreexpressen (Figura 2a). Un vector de plasmidi que portava un curt cabell anti-RNA-miR-27a (shRNA) i el casset GFP (proteïna de fluorescència verda) es va transfectar de manera estable en cèl·lules HCT116 (CTRL); es va escollir un clon cel·lular, en endavant definit MiR27a_KD, per a estudis posteriors (figura 2b). L’eficàcia del silenciament es va establir mitjançant la valoració de la disminució de miR-27a i l’augment d’objectius validats ( PPARG , ZBTB10 i FBXW7 ) (figura 2c i figura suplementària S1A). 17, 18, 19, 20 També vam transfectar cèl·lules HCT116 amb un plasmidi que porta el mímic miR-27a i, entre els clons sobreexpressius, vam seleccionar un en endavant anomenat miR27a_OE. Els extractes de cèl·lules CTRL i miR27a_KD es van analitzar mitjançant una proteïna 2DE-DIGE comparativa mostrant perfils d'expressió diferents i una reproductibilitat experimental consistent (figura suplementària S1B, taula suplementària S1). Dels 51 punts expressats de manera diferent, 27 van ser identificats per LC-MS / MS, correlacionats amb els punts corresponents i classificats en 9 classes funcionals segons les seves activitats biològiques (Figures 2d i e, Taula complementària S2). La quantificació dels punts seleccionats es mostra en una vista tridimensional juntament amb l’abundància estàndard corresponent en les dues línies cel·lulars diferents (figura 2f). La validació mitjançant anàlisi de blot occidental va revelar un augment de calreticulina (CRT), tapasina (TAPBP), GRP78, ERp57 i annexina A1 (ANXA1) i una reducció de TRAP1 en miR27a_KD respecte a les cèl·lules CTRL; els resultats inversos es van obtenir a miR27a_OE (figura 2g).

Image

El perfilat proteòmic (2DE-DIGE) identifica proteïnes i vies noves modulades per miR-27a en les línies cel·lulars CRC. ( a ) l'expressió miR-27a es va analitzar mitjançant la transcriptasa inversa-PCR quantitativa en les línies cel·lulars indicades de CRC. L’histograma informa del canvi de plec respecte a les cel·les HT29 preses com a control. S'utilitzava l'ARN U6 com a calibrador. ( b ) Les cèl·lules HCT116 es van transfectar de manera estable amb el vector miR-Zip-27a, portant l'antisens miR-27a i el gen reporter GFP, o amb el vector buit com a control. Les cèl·lules es van aïllar per expressió GFP i per als clons de miR-27a amb expressió baixa (miR27a_KD); ** P ≤0.01 (test t de Student de dues cues). ( d ) Representació esquemàtica del procediment 2DE-DIGE / MS des de la preparació i l'etiquetatge de mostres fins a l'anàlisi de gel i identificació de proteïnes. Es mostra una imatge representativa d’un gel carregat d’extractes de cèl·lules HCT116 CTRL i miR27a_KD: es van identificar uns 1200 punts de proteïna, es van quantificar, es van normalitzar i es van combinar inter-gel. Les proteïnes es van reconèixer mitjançant el canvi de plecs de les taques corresponents. ( e ) Les proteïnes identificades pel 2DE-DIGE es van classificar en nou classes funcionals, segons les seves activitats biològiques, tal com es descriuen a la taula gràfica. ( f ) Es mostra una visió tridimensional de la quantificació 2DE-DIGE juntament amb l'abundància estàndard dels punts d'interès identificats en els gels obtinguts a partir dels extractes de cèl·lules HCT116 CTRL i miR27a_KD. ( g ) Anàlisi de blot occidental de les proteïnes seleccionades identificades com a expressades de manera diferent en l’anàlisi 2DE-DIGE / MS en cèl·lules HCT116 CRTL, miR27a_KD i miR27a_OE (línia cel·lular derivada de HCT116 que sobreexpressa una miR-27a exògena). El relatiu canvi de plec de proteïna, obtingut per anàlisi densitomètrica i normalització a β- Actina, es reporta a l'histograma corresponent. * P ≤0, 05; ** P ≤0.01 (test t de Student de dues cues). Les dades són representatives de tres experiments independents i les barres d’error representen SD de rèpliques tècniques (mitjana ± SD) als panells ( a ), ( b ), ( c ) i ( g )

Imatge a mida completa

miR-27a modula l'exposició a la superfície cel·lular de classe I de MHC

Per reconèixer les vies en les quals estan implicades les proteïnes identificades, es va preguntar a l’algorisme de l’anàlisi de la trajectòria d’enginy (IPA): 21 presentació d’antigen, vies immunològiques i inflamatòries van ser les més enriquides (Figura 3a, figura suplementària S1C). En conseqüència, es va valorar l'exposició a la superfície cel·lular de molècules de classe I de MHC en tres línies cel·lulars diferents (HCT116, HT29 i RKO) i els seus clons derivats amb un miR-27a silenciat o sobreexpressat. A la citometria de flux, les cèl·lules miR27a_KD mostraven més proteïnes de classe I MHC a la superfície que les cèl·lules CTRL parentals, mentre que les cèl·lules miR27a_OE mostraven menys proteïnes (figura 3b). De la mateixa manera, en la tinció d’immunofluorescència, l’anticòs específic va reconèixer una quantitat baixa de proteïnes MHC de classe I a la membrana de cèl·lules CTRL HCT116 no permeabilitzades que van augmentar notablement a la superfície de miR27a_KD, mentre que disminuïen en les cèl·lules miR27a_OE (figura 3c). L’especificitat de la tinció es va validar contrarestant els nuclis amb DAPI: en fusionar-se, les dues tintures es van mantenir separades ja que marquen un compartiment subcel·lular diferent. Per tenir una avaluació més quantitativa de les proteïnes exposades a la superfície cel·lular, vam establir un procediment per aïllar selectivament les proteïnes de la membrana plasmàtica i avaluar-ne les incloses. La fracció de membrana de les cèl·lules miR27a_KD contenia almenys quatre vegades més molècules de classe I de MHC que CTRL i fins i tot més que cèl·lules miR27a_OE. Que les bandes corresponguessin a proteïnes de membrana real es va confirmar posant en pràctica la mateixa fracció amb E-cadherina, una proteïna de membrana integral, com a control positiu, i amb β- Actin, una proteïna citosòlica com a control negatiu (Figura 3d). Totes aquestes dades demostren que l'expressió superficial de les molècules de classe I de MHC està regulada per miR-27a.

Image

L'exposició a la superfície de les cèl·lules MHC de classe I està regulada per miR-27a a les cèl·lules CRC. ( a ) El dibuix mostra les xarxes més enriquides generades de la llista de proteïnes expressades de manera diferent (DE) (elements vermells = proteïnes regulades; elements verds = proteïnes regulades) després de silenciar miR-27a mitjançant IPA. ( b ) L'anàlisi de citometria de flux revela diferents exposicions de superfície de molècules de classe MHC de classe I a HCT116, RKO, HT29 i els seus clons derivats miR27a_KD o miR27a_OE. ( c ) Tinció d’immunofluorescència mitjançant un anticòs contra molècules de classe I de MHC humanes en CTCT HCT116 i els seus clons derivats miR27a_KD o miR27a_OE (barra d’escala, 50 μ m). ( d ) Enriquiment de molècules de classe MHC I en la fracció de membrana plasmàtica aïllada. La positivitat per a E-cadherina, una proteïna de membrana i la negativitat per a β- Actin, una proteïna citosòlica, van demostrar que les proteïnes identificades eren components integrals de la membrana. El canvi de plec relatiu, obtingut per anàlisi densitomètrica i normalització a E-cadherina, es reporta per sota de les bandes. * P ≤0, 05; ** P ≤0.01 (test t de Student de dues cues). Les dades són representatives de tres experiments independents i les barres d’error representen SD de rèpliques tècniques (mitjana ± SD)

Imatge a mida completa

miR-27a dirigeix ​​directament la calreticulina que afecta l'exposició a MHC de classe I

Per identificar un objectiu directe de miR-27a entre les proteïnes expressades de manera diferent, es van preguntar diversos algoritmes i es va predir la calreticulina com a objectiu putatiu a causa d'una seqüència de reconeixement conservada en les 3'UTR del mRNA corresponent (Figura 4a). 22 Un protector de destinació miScript (TP) es va dissenyar contra aquesta seqüència de reconeixement per evitar de manera selectiva la unió de miR-27a al mRNA corresponent, sense interferir en l’acció del miRNA sobre altres objectius. Després de la transfecció de TP, la calreticulina va augmentar en HCT116 i miR27a_OE més que les cèl·lules miR27a_KD (Figura 4b). Curiosament, també l’augment d’ARNm cognitiu, probablement a causa d’un efecte d’estabilització, contribuint a l’elevació de proteïnes detectada a les cèl·lules HCT116 i miR27a_OE (figura 4c). La transfecció de tres siRNAs independents contra l’ARNm de calreticulina a les cèl·lules HCT116, miR27a_KD i miR27a_OE va silenciar amb èxit la proteïna, amb el siRNA # 3 com el més eficient (figura 4d). Per determinar l'impacte de l'eix miR-27a / calreticulina sobre l'exposició superficial de molècules de classe I MHC, vam transfectar la calreticulina TP i els siRNAs en les tres línies cel·lulars. En la citometria de flux, la TP no va produir variacions significatives, mentre que els siRNAs, especialment siRNA # 3, van augmentar la visualització de la membrana cel·lular de classe I MHC en un 50% en miR27a_KD i en un 25-30% en cèl·lules CTRL i miR27a_OE (figura 4e), en línia amb la contingut total de la fracció de membrana plasmàtica aïllada (figura 4f). La calreticulina, per tant, és un objectiu directe de miR-27a i media els efectes sobre l’exposició a MHC de classe I.

Image

La calreticulina és un objectiu miR-27a i afecta l’exposició a la superfície cel·lular de classe I de MHC. ( a ) Representació esquemàtica de l’ARNm de calreticulina humana (CRT): el lloc d’enllaç miR-27a molt conservat situat en el 3’UTR està il·lustrat en vermell. ( b ) Anàlisi immunoblot dels nivells de CRT en HCT116 CTRL i clons derivats miR27a_KD o miR27a_OE cèl·lules després de la transfecció amb el protector específic (CRT-TP) o control negatiu (NC-TP) durant 72 h. La β -Actina es va utilitzar com a control de càrrega. * P ≤0, 05, ns = no significatiu. ( c ) Anàlisi CRR mRNA qRT-PCR de HCT116 CTRL i clons derivats miR27a_KD o cèl·lules miR27a_OE transfectades amb el CRT-TP específic o control negatiu (NC-TP) durant 72 h. * P ≤0.05 (test t de l'alumne). ( d ) Anàlisi immunoblot CRT de CTRL HCT116 i clons derivats miR27a_KD o cèl·lules miR27a_OE transfectades amb tres siRNAs CRT específics o Control SiRNA durant 72 h. L’anàlisi densitomètrica s’informa a sota de les bandes. ** P ≤0.01 (test t de l'alumne). ( e ) Valoració de la citometria de flux de molècules de classe I de MHC de superfície cel·lular a les mateixes cèl·lules que a ( b ) després de la transfecció amb CRT-TP o CRT-siRNA o controls relatius negatius durant 72 h. ( f ) Anàlisi immunoblot de molècules de classe I de MHC presents a la fracció de membrana plasmàtica de les cèl·lules CTRL HCT116 i els seus clons derivats miR27a_KD o miR27a_OE transfectats amb els CRT-siRNAs o control de siRNA revoltats (Ctrl-siRNA). Les dades normalitzades a E-cadherina es mostren als histogrames. * P ≤0.05, ** P ≤0.01 enfront de cèl·lules CTRL HCT116; # P ≤0.05 versus ctrl-siRNAs transfectades cèl·lules

Imatge a mida completa

Els xenografts de ratolí recapitulen els efectes miR-27a sobre el perfil proteòmic i el creixement cel·lular

Per investigar la modulació de miR-27a a les proteïnes identificades per 2DE-DIGE in vitro , es van generar xenografts de ratolí. Es van trasplantar per via subcutània els ratolins HCT116 i HT29, representatius de les cèl·lules que sobreexpressen o sobreexpressen les ombrespressores. Al cap de dues setmanes, es va injectar intratumoralment un inhibidor de miR-27a o controls revoltats cada 7 dies durant quatre vegades en tumors derivats de HCT116. Com a alternativa, es va injectar un mític miR-27a o controls revoltats en tumors derivats de HT29. Al dia 36 després del trasplantament, es van mesurar, excisar i analitzar masses tumorals. La mida de les malalties malignes derivades de HCT116 va ser notablement més gran (> 50%) que les que s’injectaven amb l’antisens miR-27a. Així mateix, els tumors obtinguts després de la injecció d'un miR-27a imiten en masses derivades de cèl·lules HT29 eren> 50% més grans que les de les cèl·lules parentals (figura 5a). L’especificitat i l’eficàcia de la inhibició o sobreexpressió de miR-27a es va verificar per qRT-PCR sobre els ARN totals extrets dels dos tipus diferents de tumors. D’acord amb la mida, la positivitat de Ki67 era més forta en els tumors amb alta expressió de miR27a que els inferiors, donant suport a un paper d’aquest miRNA en la proliferació cel·lular (Figs complementàries S3A i B). Per contra, l’apoptosi es va reduir molt en els mateixos tumors, mentre que es van detectar grans àrees d’apoptosi en aquelles que expressen miR-27a baixa per un test de marcatge final de la deutinucleotidil-transferasa (TdT) de DUTP nick (TUNEL). c).

Image

miR-27a actua com un miRNA oncogènic en xenografts de ratolí. ( a ) Fotografies representatives de les masses tumorals de xenograft excisades de cada grup experimental. Inhibidor de miR-27a (anti-miR-27a; n = 5) i control revoltat (miR-Ctrl; n = 5) en cèl·lules HCT116 o mímica miR-27a (miR-27a; n = 5) i control revoltat (miR- Ctrl; n = 5) a les cèl·lules HT29 es van injectar intratumoralment cada 7 dies durant quatre cicles a partir del dia en què els tumors van assolir el volum de 200 mm 3 . S'informa de la corba de creixement dels tumors en ambdós tipus de xenografts. ( b ) Fotomicrografies representatives de la tinció d'hematoxilina i eosina, calreticulina i anàlisi MHC classe I IHC i assaig TUNEL, respectivament, realitzades en seccions incrustades de parafina dels mateixos teixits; barres a escala, 200 μ m. ( c ) L'histograma mostra l'índex d'apoptòtic determinat pel test TUNEL. ( d ) Anàlisi de blot occidental del gen de proteïnes seleccionades identificat per 2DE-DIGE realitzat sobre extractes de proteïnes totals de xenografts de ratolí i ( e ) la seva quantificació relativa. Les dades es representen com a mitjans ± SD d’almenys dos tumors tractats de manera independent; * P ≤0, 05; ** P ≤0.01 (test t de l'alumne)

Imatge a mida completa

La calreticulina, ERp57, GRP78 / BiP, Annexin1 i Tapaxin van ser regulades a l’anàlisi de blot occidental d’extractes de tumors de l’HCT116, mentre que tots es van regular en aquells amb un miR-27a silenciat. TRAP1 va mostrar un comportament invers, d'acord amb els resultats 2DE-DIGE in vitro (figures 5d i e). L'anàlisi dels mateixos marcadors en tumors HT29 va produir un escenari contrari, en línia amb la menor expressió de miR-27a que es va revertir després de la injecció del mímic corresponent. No es van observar variacions per a totes les proteïnes indicades en els blots occidentals d’extractes de tumors injectats amb control revoltats respecte als tumors derivats de l’HCT116 o HT29 (dades no mostrades).

L’expressió MHC de classe I va ser supervisada per immunohistoquímica (IHC). El senyal detectat a seccions de teixit procedents de tumors injectats per antisens miR-27a era més fort que no pas dels tumors de cèl·lules injectades o parentals. Amb una ampliació més gran, la tinció es va localitzar a la membrana cel·lular, de forma consistent amb l'estimulació de la transferència de superfícies cel·lulars de classe I de MHC després del silenciament de miR-27a. Una anàlisi de quantificació occidental més quantitativa sobre extractes dels mateixos tumors va confirmar en un model de ratolí que el silenciament miR-27a estava associat a un augment global de les proteïnes MHC de classe I (Figures 5b, d i e). De forma consistent, la calreticulina mostrava una positivitat feble i principalment citosòlica en seccions de tumors HCT116 per IHC. En canvi, la tinció es va localitzar notablement com a "pegats" a les membranes cel·lulars en tumors injectats amb un antisens miR-27a (figura 5b). L’anàlisi Western blotting dels extractes dels mateixos teixits va mostrar un augment global de calreticulina només en aquelles masses amb un miR-27a reduït (Figures 5d i e). Col·lectivament, els xenografts de ratolí van confirmar que miR-27a afecta el creixement cel·lular i l’apoptosi també en CRC i va mostrar clarament que modula negativament un conjunt específic de proteïnes identificades in vitro que contribueixen específicament a l’expressió de classe MHC I. Aquests resultats demostren definitivament que miR-27a és un factor inductor de tumors de CRC que actua com a oncomiRNA.

L'expressió miR-27a en CRC es correlaciona inversament amb l'expressió MHC de classe I i calreticulina i amb infiltració / activació de cèl·lules T CD3 + i CD8 +

Per correlacionar les dades obtingudes in vitro i en xenografts de ratolí amb CRCs humans, es va realitzar una anàlisi quantitativa occidental d’algunes mostres representatives: els CRC alts que expressen miR-27a mostraven molècules baixes de MHC classe I i calreticulina (figures 6a i b). D’acord amb això, l’IHC de microarrays de teixit va demostrar que els tumors amb alta expressió de miR-27a mostraven freqüentment una tinció de membrana dèbil o absent per a molècules de classe I de MHC i calreticulina; la tinció va ser més forta en tumors baixos que expressaven miR-27a (Figura 6c). A més, el miR-27a es va correlacionar inversament amb la infiltració de les cèl·lules T CD3 + i CD8 + i la positivitat de la perforina la abundància relativa de la qual es va determinar (figures 6c i d). La perforina i el LAMP-1 són dues proteïnes de membrana utilitzades com a marcadors subrogats de l'activitat citotòxica de les cèl·lules T CD8 + . Així, les cèl·lules dobles positives de CD8 + / perforina + i CD8 + / LAMP-1 +, detectades per immunofluorescència en exemplars de CRC, van ser més elevades en tumors amb baixa expressió de miR-27a (figures 7A i B). En conjunt, aquests resultats suggereixen que miR-27a podria afectar la infiltració, l’activació, la proliferació i la desgranulació de les cèl·lules T. 24 De manera consistent, l’anàlisi de Kaplan i Meier de la supervivència dels pacients va demostrar que l’expressió de calreticulina baixa ( P <0, 001) i CD3 + i CD8 + infiltrats baixos ( P <0, 001), presos sols, es van associar significativament amb una supervivència global més curta, mentre que una alta miR -27a només va mostrar una tendència ( P = 0.104; figures suplementàries S4A i B). L’associació baixa calreticulina / alta miR-27a ( n = 26) va ser la que va tenir pitjor resultat quan es van combinar aquestes característiques; L’anàlisi de les proporcions de perillositat de totes les associacions possibles va identificar la calreticulina com a una variable dominant que era encara més discriminant quan s’acompanyava amb l’expressió alta miR-27a. Quan els infiltrats CD8 + es van associar als nivells de miR-27a, la combinació baixa de CD8 + / alta de miR-27a va tenir pitjor pronòstic; L’anàlisi de les proporcions de perillositat de totes les associacions possibles va posar de relleu la presència d’infiltrats CD8 + com a variable dominant (figures 7C i D). Una alta miR-27a / baixa calreticulina també es va associar amb el desenvolupament de metàstasi hepàtica i els infiltrats de cèl·lules T CD3 + / CD8 + es van reduir en metàstasis en comparació amb els tumors primaris coincidents (Figures complementàries S4C-E).

Image

La regulació de miR-27a en mostres de CRC es correlaciona amb l'expressió reduïda de MHC de classe I i la calreticulina i la infiltració de cèl·lules T CD3 + i CD8 + . ( a ) Anàlisi de blot occidental de molècules de classe I CRT i MHC en un grup representatiu de teixits normals ( n = 5) i mostres de CRC ( n = 9) classificades segons l'expressió miR-27a; La β -Actina es va utilitzar com a control de càrrega. ( b ) Les parcel·les de caixa registren nivells de classe I CRT i MHC en els teixits normals versus tumor (superior) i en els teixits tumorals segons els nivells de miR-27a (inferior). ( c ) Anàlisi de IHC de MHC classe I, CRT, CD3 + i CD8 + cèl·lules T infiltrades en mostres incrustades en parafina d’exemplars normals i CRC classificats segons els nivells de miR-27a (barra d’escala, 50 μ m). ( d ) Les parcel·les de caixa reporten infiltracions de cèl·lules T CD3 + i CD8 + relacionades amb els nivells de miR-27a. Els valors P es van calcular mitjançant la prova t aparellada als panells ( b ) i ( d )

Imatge a mida completa

Image

miR-27a està associat inversament amb la infiltració i activació de cèl·lules T CD8 + que afecten l’agressivitat del tumor i la supervivència dels pacients. ( A ) Anàlisi de l’IHC de miR-27a, cèl·lules T CD8 + i perforina en mostres incrustades en parafina d’exemplars de CRC classificades segons diferents estadis tumorals (estadis I – II vers III – IV) (barra d’escala, 50 μ m). Els histogrames a continuació indiquen la quantificació de la tinció de CD8 / perforina expressada com el nombre mitjà de cèl·lules positives en camps d'alta potència (HPFs). ( B ) Anàlisi d'immunofluorescència de cèl·lules de CD8 + (vermell) i LAMP1 + (verd) o CD8 + i perforina + de doble taca (barres d'escala: 20 μ m als panells a i b, i 5 μ m als panells b i d ) . Els histogrames de la dreta mostren el percentatge de cèl·lules CD8 + / LAMP1 + i CD8 + / perforina + dobles positives en els teixits tumorals segons els nivells de miR-27a ** P ≤0.01 (test t de dos estudiants). ( C i D ) Anàlisi de supervivència de Kaplan-Meier de pacients amb CRC a partir de ( C ) CRT / miR-27a i ( D ) CD8 + / miR-27a. Test de classificació del registre; P = 0, 012, P = 0, 096. Les anàlisis de les proporcions de perillositat es registren a les caselles del costat dret

Imatge a mida completa

Dos conjunts de dades disponibles públicament es van confirmar la rellevància biològica d’aquestes dades. L' expressió 15, 16 miR-27a va augmentar notablement amb la estadització del tumor i es va correlacionar inversament amb la supervivència global dels pacients, d'acord amb els resultats del nostre conjunt de dades (figura suplementària S5A). Curiosament, mentre que l’ARNm de la calreticulina es va augmentar en tots els conjunts de dades, es va reduir la proteïna corresponent, una discrepància explicada pel control posttranscripció mediada per miR-27a que s’informa aquí (Figures suplementàries S6A i B; Figures 6a – c). miR-27a es va associar inversament amb els ARNm de les cèl·lules T CD3 + i CD8 + de les primeres etapes del tumor i correlacionats amb un pronòstic deficient, donant suport als resultats de la nostra sèrie (Figures suplementàries S6C-E). Col·lectivament, miR-27a actua com un oncomiRNA de les fases primerenques de la tumourigenesi del colon, deteriora l'expressió MHC de classe I i la calreticulina, correlaciona amb la infiltració CD3 + / CD8 +, el desenvolupament de metàstasis llunyanes i un resultat més deficient que afectarà la resposta immune antitumoral hoste in vivo. .

Discussió

Donar a conèixer la gamma completa de funcions d’un microARN és una tasca important ja que estan involucrats en un ampli ventall de processos biològics. A més, simultàniament s’orienten a molts gens que actuen per vies diferents, les interaccions dels quals generen una xarxa que pot ser diferent en contextos i tipus cel·lulars diferents. 4, 5, 13 Amb un enfocament proteòmic 2DE-DIGE, identifiquem una sèrie de proteïnes modulades per miR-27a implicades en l’expressió MHC de classe I. Concretament, miR-27a reprimeix l'exposició superficial MHC classe I dirigida directament a la calreticulina, una proteïna implicada en el control de qualitat del muntatge d'aquest complex multi-subunitat que contribueix a la seva estabilitat i recuperació de molècules de MHC de classe I suboptimament muntades. 7, 8, 9, 10, 11 De manera mecànica, la calreticulina és un dels principals efectors de miR-27a a l’hora de reprimir l’exposició superficial MHC de classe I, un esdeveniment pivot per obtenir una resposta immune eficient i l’eradicació del tumor. Els defectes en aquest procés són un mitjà comú per a que les cèl·lules canceroses eviten el reconeixement de les cèl·lules T. 25, 26 Les dades in vivo donen suport a aquesta noció: els tumors amb alta expressió de miR-27a es correlacionen inversament amb l'expressió de classe MHC I de la nostra sèrie CRC. Tot i que es requereixen estudis addicionals per proporcionar una visió mecànica del vincle entre miR-27a i presentació de l'antigen de classe I MHC i, en definitiva, el reconeixement i l'activació de les cèl·lules T CD8 +, les nostres dades actuals indiquen que l'eix miR-27a / calreticulina regula la classe MHC Expressió de la superfície cel·lular La reglació del miR-27a es produeix des de les fases molt primerenques de la tumourigenesi colorectal i persisteix durant tota la progressió, donant lloc a un desenvolupament més agressiu. En línia, els CRC que expressen la combinació alta miR-27a / baixa calreticulina s’associen a infiltrats reduïts de les cèl·lules T CD3 + / CD8 + i a l’activitat citotòxica, un comportament més agressiu, una propagació metastàtica i un pitjor resultat. L’escenari emergent és que el tumor i les cèl·lules veïnes, especialment infiltrant-se a les cèl·lules immunes, estableixen un microambient específic a través d’una xarxa complexa de crosstalks. 27, 28 miR-27a és crucial en les cèl·lules immunes, ja que inhibeix la maduració del DC i la proliferació i activació de les cèl·lules T, mentre que indueix la maduració dels subtipus de macròfags M2b i M2c. 29, 30, 31 Aquí proporcionem proves que el miR-27a té un paper clau també en les cèl·lules tumorals en reprimir l’exposició a la superfície cel·lular de classe I de MHC. MiR-27a sembla ser una molècula de senyalització polifacètica que pot influir en les interaccions immunològiques cèl·lules tumorals-host que probablement inhabilitin components del sistema immune que han estat enviats per eliminar-los.

En conclusió, demostrem per primera vegada que miR-27a modula l'exposició a la superfície de classe I de MHC dirigint-se directament a la calreticulina. Les nostres dades confirmen que miR-27a té un paper crític en la tumourigènesi de còlon que probablement influencia la resposta immune antitumoral. La identificació d’un eix regulador de la miR27a-calreticulina obre vies per a la recerca de noves estratègies dirigides a millorar el pronòstic del pacient i millorar la resposta terapèutica.

Materials i mètodes

Cultiu cel·lular

Les línies cel·lulars de càncer de còlon humà HCT116, HT29, CaCo-2, LoVo, RKO i SW480 es van comprar a la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). Totes les línies cel·lulars es van mantenir en el medi modificat de Dulbecco Eagle o RPMI 1640 complementat amb un sèrum boví fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicil·lina i estreptomicina. Les cèl·lules es conreaven en una incubadora humidificada a 37 ° C a un 5% de CO 2 . Les cèl·lules endotelials del cordó umbilical humà es van comprar a ATTC i es van mantenir al medi EGM BulletKit (Lonza, Allendale, NJ, EUA).

Transferència d’oligonucleòtids i plasmids

El mític sintètic miR-27a (Syn-hsa-miR-27a), inhibidor miR-27a (anti-hsa-miR-27a) o els controls revoltats adequats (AllStar o mirScript Inhibitor-Negative Control) es van comprar a Qiagen (Hilden, Alemanya) ). Els plasmids miR-27a-antisense (MZIP27a-PA-1), les expressions de pre-miR-27a (PMIRH27a-onlyPA-1) i plasmides de control miRNA (MZIP000-PA-1; PMIRH000PA-1) (System Biosciences, Mountain) View, CA, EUA) es van transfectar a les diferents línies cel·lulars CRC. Els estudis funcionals de microRNA es van realitzar mitjançant la inhibició de les interaccions diana miRNA-ARNm o bé amb un protector de destinació de calreticulina-miScript dissenyat a mida o amb un control negatiu de miScript Target Protector (MTP0075035; Qiagen). La detecció de cap variació en proteïnes no relacionades va validar l'especificitat de la TP. En les transfections transitòries es va utilitzar un paquet específic de gen de tres siRNA preseleccionats contra la calreticulina (Flexi Tube siRNA GS811) o un siRNA de control negatiu (SI03650325) (Qiagen). Es van realitzar anàlisis funcionals, anàlisis d’ARN i proteïnes en les 24/72 h de les transfeccions. En cada experiment, es va avaluar l'extensió del silenciament / sobreexpressió i sobreexpressió de miR-27a mitjançant el qRT-PCR i l'anàlisi de blot occidental, respectivament. Els plasmids i oligonucleòtids van ser transfectats mitjançant Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA), el reactiu de transfecció HiPerFect (Qiagen) o RNAi Max (Thermo Fisher), respectivament, segons les recomanacions dels fabricants.

extracció d'ARNm / miRNA i anàlisi qRT-PCR

L’ARN total s’ha extret de cèl·lules i teixits mitjançant TRIzol (Thermo Fisher) i tractat amb DNase I. Els microRNAs s’han extret mitjançant el Qiagen miRNeasy Mini Kit (Qiagen) segons el protocol del fabricant. L'avaluació de la puresa i quantitat de l'ARN es va realitzar tal com es descriu. 32 Les seqüències dels impriments específics es mostren a la taula complementària S3.

Anàlisi de taquilla occidental

Els extractes de proteïnes de les línies i teixits cel·lulars es van preparar i analitzar com es va informar anteriorment. 32 anticossos a la calreticulina (ab2907), TAPBP (ab140982), ERP57 (ab13506) i MHC classe I (ab70328) eren d’Abcam (Cambridge, MA, EUA); PPAR γ (sc-7273), TRAP1 (sc-9134), GRP78 (sc-13968), anti-mouse (sc-2031) i anti-conill (sc-2004) eren de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EUA ); ANXA1 (71–3400) de Thermo Fisher, β- Actin (F-3022) de Sigma-Aldrich (Milà, Itàlia); E-cadherina (BD 610405) de transducció BD (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). Per analitzar les proteïnes de superfície, es va utilitzar un mètode d’extracció basat en un procediment publicat. La positivitat per a la E-cadherina, una proteïna de la membrana plasmàtica i la negativitat per a la β- Actina, una proteïna citosòlica, van demostrar que les proteïnes identificades eren components integrals de la membrana. La tinció de blau de Comassie també es va utilitzar per avaluar la càrrega de proteïna equivalent. Les proteïnes es van analitzar mitjançant taquilla occidental, com es va informar anteriorment. 32, 33

Anàlisi 2DE DIGE

L’anàlisi del proteoma diferencial sobre CTRL HCT116 i HCT116 miR27a_KD es va realitzar tal com es va descriure anteriorment per Milone et al. Els experiments proteòmics van incloure: (a) preparació i etiquetatge de proteïnes amb colorants DIGE; (b) isoelectrofocusing (IEF); (c) adquisició, anàlisi i processament d'imatges; i (d) identificació de proteïnes mitjançant LC-MS / MS. El disseny experimental amb l'aproximació de tres colorants està il·lustrat a la taula complementària S1.

Experiments amb animals

Per a la generació de xenografts, es van trasplantar per via subcutània 20 × 10 6 cèl·lules derivades del CRC (HCT116 o HT29) al nou flotant de 20 ratolins nus atímics femenins (entre 6 i 8 setmanes; Charles River, Lecco, Itàlia). Els ratolins es van mantenir segons les directrius del Comitè Coordinador per a la Recerca del Càncer del Regne Unit, i els volums de tumors, calculats com (longitud del tumor × amplada2) / 2, van ser controlats dos cops per setmana mitjançant la mesura de l’alcohol. 35, 36 Dues setmanes després del trasplantament, quan els tumors van assolir el volum de 200 mm 3, els ratolins es van agrupar ( N = 5 / grup) i es van injectar intratumoralment cada 7 dies durant quatre vegades amb anti-miR-27a (4 ng / mm 3 ) per HCT116 o amb mímica miR-27a (2 ng / mm 3 ) per a models xenograft HT29. En ambdós casos, es van utilitzar els ARN revoltats adequats (indicats com a anti-miR-Ctrl i miR-Ctrl, respectivament). Al dia 36, ​​es van mesurar, excisar i analitzar més masses de tumors; qRT-PCR es va realitzar en RNA a partir de xenografts per establir l'eficiència de la inhibició / sobreexpressió del miR-27a. Aquest experiment es va dur a terme per duplicat. No es van observar efectes adversos o tòxics. Tots els experiments amb animals van ser revisats i aprovats per la Comissió d’Ètica a Menarini Ricerche, segons les directrius de la Directiva Europea (2010/63 / UE).

Prova de TUNEL

Per avaluar la taxa apoptòtica en els teixits de xenograft, es van analitzar les masses de tumors incrustats en parafina mitjançant el sistema DeadEnd Fluorometric TUNEL (Promega, Madison, WI, EUA), segons les instruccions del fabricant. L’adquisició d’imatges i les anàlisis de dades es van realitzar mitjançant un microscopi d’exploració làser Carl Zeiss LSM700 (Carl Zeiss, Jena, Alemanya).

Immunofluorescència i IHC

Es va realitzar una tinció d’immunofluorescència en HCT116 i derivats no permeabilitzats. Les cèl·lules es van xapar amb copes de fixació, fixades en para-formaldehid (4% en PBS) a temperatura ambient durant 10 min, bloquejades en albumina sèrica bovina (3% en PBS) durant 30 min abans de la incubació amb anticossos específics de MHC classe I (1: 100 dilucions) durant 1 h a temperatura ambient. Posteriorment, es va incubar un anticòs secundari anti-ratolí IgG-R (sc-2092, dilució 1: 1000) (Santa Cruz Biotechnology) durant 1 h a temperatura ambient. Les llavis de cobertor es van rentar amb PBS, es van tacar amb DAPI i, després de tres rentats més en PBS freda, es van muntar en mowiol 4-88 (Merck-Millipore, Darmstadt, Alemanya) sobre diapositives de vidre. For double-immunofluorescence staining, after an initial block with 10% normal serum in PBS, tissue sections were incubated overnight at 4 °C with an unconjugated primary antibody specific for CD107a (also known as LAMP-1) FITC (ab25406) or a monoclonal antibody to perforin (Clone 5B10; Diagnostic Biosystems, Pleasanton, CA, USA) and CD8-PerCP-Cy5.5 fluorescence conjugated (BD Biosciences). For negative controls, primary antibodies were replaced with preimmune serum and IgG isotype controls. The fluorescence signals were observed and captured using a Carl Zeiss LSM700 laser-scanning microscope (Carl Zeiss). IHC and haematoxylin and eosin staining on human CRC tissues and mouse xenografted tissues were performed and evaluated as previously reported 32 using antibodies against Ki67 (Dako, Milan, Italy), Calreticulin and MHC class I, CD3 (CD3-565-L-CE) and CD8 (CD8-295-CE) (Novocastra, Milan, Italy) and perforin (Diagnostic Biosystems). Image acquisition and analysis were performed on DM100 Leica Photosystem 40.106.206 (Leica, Milan, Italy).

Citometria de flux

Flow cytometry was employed to detect MHC Class I molecules on the cell surface of HCT116, RKO and HT29 and their derivative clones miR27a_KD or miR27a_OE. Briefly, cells were plated, harvested and washed twice with PBS and incubated for 1 h in darkness at 4 °C with PE-Cy-7-labelled anti-MHC class I (561349) (BD Biosciences). Cells were then washed and resuspended in cold PBS for FACS analysis. All flow cytometry results were analysed with the FACSuite Software v.1.0.5.3841 (BD Biosciences).

In vitro angiogenesis assay

The tube-formation assay was performed as previously described 32 and is illustrated in Supplementary Figure S2A.

In situ RNA hybridization

Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) sections of tubular adenomas with low-grade/high-grade dysplasia or colorectal adenocarcinomas (G1, G2 and G3) were stained for miR-27a. Three cases per pathological sub-group were analysed. Three normal colonic mucosa biopsy samples, used as control, were obtained from patients who underwent colonoscopy for irritable bowel syndrome. miR-27a probe was labelled with 5-digoxigenin and synthesized by Exiqon (Vedbaek, Denmark). In situ hybridization was performed as described, with minor modifications. 37 Negative controls included omission of the probe and the use of a scrambled LNA probe; U6 was used as positive control (Exiqon). Slides were counterstained in fast red solution. For miR-27a/CD8 + /perforin expression analysis, primary sporadic CRCs were considered. Serial sections obtained from the original paraffin blocks were stained for miR-27a, CD8 + and perforin. Only cytoplasmic miR-27a intensity was retained for scoring, and miRNA expression was quantified analysing chromogen-specific intensity by Image J. 38 IHC for CD8 + (Clone C8/144B; Dako) and perforin (Diagnostic Biosystem) were performed on the Benchmark LT automated system from Leica Microsystems Bondmax (Leica, Wetzlar, Germany) according to the manufacturer's specifications. The results of CD8 + /perforin staining are expressed as the mean number of positive cells in high-power fields.

Mostres clíniques

Paraffin-embedded and liquid nitrogen–frozen specimens from adenoma ( n =32) and primary sporadic CRCs ( n =80) (stages I–II, n =48; stages III–IV, n =32) were included in this study. Each sample was matched with the adjacent apparently normal mucosa ( n =80) removed during the same surgery. Patients' familial history and tumour classification have been reported. 32 Patients were followed up for a median of 89.79 months or until death. All patients gave informed consent for sample collection, and study protocols were approved by the Institutional Review Board of the Fatebenefratelli Hospital in accordance with the ethical guidelines of the Declaration of Helsinki.

Independent data sets' analysis

The following independent, publicly available adenoma and CRC data sets, deposited in the Gene Expression Omnibus (GEO) as adenoma E-MTAB-813, 14 (GEO) GSE35602 series (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo website) and TCGA COAD series (//tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/coadread_2012), respectively, were analysed for miR-27a expression in adenoma and CRC tissues to evaluate its prognostic significance. The adenoma data set consists of 21 patients while the data set GSE35602 counts on 59 RNA samples separately extracted from stroma and epithelium of 13 CRC tissues and four normal tissues. 15 mRNA expression analysis was performed on Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); for miRNA analysis, Agilent-019118 Human miRNA Microarray 2.0 G4470B was used. Robust multichip average normalization was performed using GeneSpring 11.5 (Agilent Technologies). 39 The information from this data set was used to identify differentially expressed miRNAs having a fold change ≥2 and P <0.05, as determined by Welch t -test statistical analysis. We performed Volcano plot analysis to visualize differential expression. TCGA COAD data set 16 consists of 224 colorectal tumours and normal pairs. Normalized Level 3 data were used for our analysis. IPA (Ingenuity Systems, (//www.ingenuity.com website) was used for gene set enrichment analysis and gene network analysis.

Estadístiques

All statistical analyses were made using Statistical Package from Social Science (SPSS; version 16.0) for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) and R/Bioconductor (Seattle, WA, USA). Association between miRNA expression and tumour stage was assessed using Fisher exact test or Pearson χ2 test (where indicated). The Kaplan–Meier method was used to estimate survival; log-rank test was used to test differences between the survival curves; the hazard ratios were calculated by combining the variables at 95% confidence interval to correlate the chance of events. Data are reported as means±SD, and mean values were compared using Student's t -test or Mann–Whitney test. Results were considered statistically significant when P ≤0.05 was obtained.

Informació complementària

Documents de paraula

  1. 1.

    Informació complementària

Glossari

CRC

càncer de colon

PLC

peptide-loading complex

MHC

major histocompatibility complex

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)