Protocols (Abril 2020)

L’ús del laberint més elevat com a assaig de conductes relacionades amb l’ansietat en rosegadors

L’ús del laberint més elevat com a assaig de conductes relacionades amb l’ansietat en rosegadors

Resum El laberint plus elevat és un assaig de conducta àmpliament utilitzat per a rosegadors i ha estat validat per avaluar els efectes anti-ansietat dels agents farmacològics i les hormones esteroides i per definir les regions i els mecanismes del cervell relacionats amb l’angoixa. Breument, les rates o els ratolins es col·loquen a la unió dels quatre braços del laberint, de cara a un braç obert, i les entrades / durada de cada braç són registrades per un sistema de seguiment de vídeo i un observador simultàniament durant 5 minuts. També es po

Generació d'una població definida i uniforme de progenitors i neurones del SNC a partir de cèl·lules mare embrionàries del ratolí

Generació d'una població definida i uniforme de progenitors i neurones del SNC a partir de cèl·lules mare embrionàries del ratolí

Resum Es descriu un protocol detallat que permet generar poblacions essencialment pures de neurones glutamatergiques a partir de cèl·lules mare embrionàries de ratolí (ES). Es basa en el cultiu de cèl·lules ES que es mantenen no diferenciades per divisió repetida i posteriorment amplificades com a agregats cel·lulars no adherents. El tra

Corrigendum: un protocol normalitzat per a l'estrès de la derrota social repetida en els ratolins

Corrigendum: un protocol normalitzat per a l'estrès de la derrota social repetida en els ratolins

L'article original es va publicar el 21 de juliol de 2011 Nat. Protoc. 6 , 1183–1191 (2011); doi: 10.1038 / nprot.2011.361; publicat en línia el 21 de juliol de 2011; corregit després de la impressió el 17 de desembre de 2014 A la versió d’aquest article publicat inicialment, hi va haver certa confusió sobre la interpretació de la sentència “A més, les derrotes haurien de ser executades sota una avaluació veterinària constant i amb l’aprovació completa de tots els consells i normes institucionals necessaris”. Per a una major cla

Ensenyament de citocinesis per bloqueig de cítomes de micronucli

Ensenyament de citocinesis per bloqueig de cítomes de micronucli

Aquest article s'ha actualitzat Resum El test de cítomes de micronucleus amb bloc de citocinesis és un sistema complet per a mesurar el dany, la citostàsia i la citotoxicitat de l'ADN. Els esdeveniments de dany de l'ADN es classifiquen específicament en cèl·lules binucleades (BN) dividides una vegada i inclouen (a) micronucleis (MNi), un biomarcador de ruptura de cromosomes i / o pèrdua de cromosomes sencers, (b) ponts nucleoplasmàtics (NPBs), un biomarcador d'ADN. mal fu

Incorporació específica del lloc de fluorotrosines a la subunitat R2 de la ribonucleotida reductasa de E. coli mitjançant lligament de proteïna expressat

Incorporació específica del lloc de fluorotrosines a la subunitat R2 de la ribonucleotida reductasa de E. coli mitjançant lligament de proteïna expressat

Resum La lligadura de proteïna expressada (EPL) permet la semisíntesi d’una proteïna diana amb la incorporació específica del lloc de sondes o aminoàcids no naturals als seus N o C terminals. A continuació, es descriu el protocol que el nostre laboratori ha desenvolupat per incorporar fluorotrosines (F n Ys) al residu 356 de la petita subunitat d' Escherichia coli ribonucleotide reductase mitjançant EPL. En aques

Correcció: anàlisi del número de còpies de tot el genoma de cèl·lules simples

Correcció: anàlisi del número de còpies de tot el genoma de cèl·lules simples

L'article original es va publicar el 3 de maig de 2012 Nat. Protoc. 7 , 1024-1041 (2012); publicat en línia el 3 de maig de 2012; corregit després de la impressió el 24 de febrer de 2016 A la versió d’aquest article publicat inicialment, les unitats per a la concentració de NaCl al tampó NST descrit a la secció Configuració dels reactius eren incorrectes. La unita

Un assaig de micronucli in vivo amb un gran rendiment per a cribratge d'inestabilitat del genoma en ratolins

Un assaig de micronucli in vivo amb un gran rendiment per a cribratge d'inestabilitat del genoma en ratolins

Temes Dany i reparació de l'ADN Citometria de flux Inestabilitat genòmica Ratolí Resum Es descriu un mètode sensible, robust i de gran rendiment per quantificar la formació de micronucleis, marcadors de la inestabilitat del genoma en els eritròcits del ratolí. Els micronucleis són cromosomes sencers o segments de cromosomes que s’han separat del nucli. Altres m

Cribratge d’activitats del substrat (SAS): un procediment general per a la preparació i cribratge d’una biblioteca de substrats de proteasa no peptídica basada en un fragment per descobrir inhibidors

Cribratge d’activitats del substrat (SAS): un procediment general per a la preparació i cribratge d’una biblioteca de substrats de proteasa no peptídica basada en un fragment per descobrir inhibidors

Resum El cribratge d’activitats del substrat (SAS) és un mètode basat en fragments per al desenvolupament ràpid de nous substrats i la seva conversió en inhibidors no peptídics de les proteases Cys i Ser. El mètode consta de tres passos: (i) es projecta una biblioteca de N- acil aminocoumarines amb diversos grups de N- acil de baix pes molecular per identificar substrats de proteases utilitzant un assaig basat en fluorescència; (ii) els substrats identificats amb N- acil aminocoumarin s’optimitzen mitjançant una ràpida síntesi i avaluació analògica; i (iii) els substrats optimitzats es converte

Cultiu primari de cèl·lules de cromafina bovina

Cultiu primari de cèl·lules de cromafina bovina

Resum Aquest protocol descriu el cultiu principal de cèl·lules cromafines individuals derivades per digestió enzimàtica de la medul·la suprarenal de la glàndula suprarenal bovina. Des de finals dels anys setanta, aquestes cèl·lules han proporcionat un sistema de model útil per estudiar la biosíntesi, emmagatzematge i alliberament de neurotransmissors en el sistema catecolaminèrgic. El protoc

Anàlisis basades en el biosensor per PQS, HHQ i molècules de senyal de quòrum de 2-alquil-4-quinolona relacionades

Anàlisis basades en el biosensor per PQS, HHQ i molècules de senyal de quòrum de 2-alquil-4-quinolona relacionades

Resum 2-Alquil-4-quinolones (AHQs) com ara 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolona (PQS) i 2-heptil-4-quinolona (HHQ) són molècules de senyal que detecten quòrum. A continuació, es descriuen els mètodes per a la detecció, identificació i quantificació provisional de AHQ, que utilitzen una soca biosensora AHQ de Pseudomonas aeruginosa basada en lux . El pro

Anàlisi quantitativa dels assajos de captura de conformació cromosòmica (3C-qPCR)

Anàlisi quantitativa dels assajos de captura de conformació cromosòmica (3C-qPCR)

Resum La tecnologia de captura de conformació cromosòmica (3C) és una metodologia pionera que permet explorar l’organització genòmica in vivo a una escala que abasta unes quantes desenes fins a uns quants centenars de quilobases. Comprendre el plegament del genoma a aquesta escala és especialment important en mamífers on elements reguladors dispersos, com a potenciadors o aïllants, participen en la regulació gènica. La tecnolo

Generació d’extractes lliures de cèl·lules d’ous Xenopus i cromatina d’espermatozoides desmembrats per al muntatge i l’aïllament de nuclis formats in vitro per microscòpia electrònica de blot i escaneig Western (SEM)

Generació d’extractes lliures de cèl·lules d’ous Xenopus i cromatina d’espermatozoides desmembrats per al muntatge i l’aïllament de nuclis formats in vitro per microscòpia electrònica de blot i escaneig Western (SEM)

Resum Aquest protocol detalla els mètodes per a la generació d’extractes lliures de cèl·lules i plantilles d’ADN dels òvuls i la cromatina d’espermatozoides, respectivament, del gripau clapat Xenopus laevis . Hem utilitzat aquest sistema amb microscòpia electrònica d’escaneig (SEM), tal com es detalla aquí, per analitzar els requeriments bioquímics i les vies estructurals per a la biogènesi d’envolupants nuclears eucariotes (NE) i complexos de porus nuclears (NPCs). Aquest protocol re

Obtenció de genomes a partir de microorganismes ambientals no cultivats mitjançant genòmica unicel·lular basada en FACS

Obtenció de genomes a partir de microorganismes ambientals no cultivats mitjançant genòmica unicel·lular basada en FACS

Temes Microbiologia ambiental Citometria de flux Genòmica Amplificació del genoma complet Resum La genòmica unicel·lular és una potent eina per explorar el maquillatge genètic de microorganismes ambientals, la gran majoria dels quals són difícils, si no impossible, de conrear amb els enfocaments actuals. Aquí p

Artritis induïda pel col·lagen

Artritis induïda pel col·lagen

Resum El model de ratolí amb artritis induïda per col·lagen (CIA) és el model autoimmune d’artritis reumatoide més estudiat. L’artritis autoimmune s’indueix en aquest model per immunització amb una emulsió d’adjuvant complet de Freund i col·lagen de tipus II (CII). Aquest protocol descriu els passos necessaris per a l’adquisició, manipulació i preparació de l’IIII, així com la selecció de soques de ratolí, una tècnica d’immunització adequada i l’avaluació de la incidència i la gravetat de l’artritis. Típicament, en aquest model aparei

Generació d’organoides cerebrals a partir de cèl·lules mare pluripotents humanes

Generació d’organoides cerebrals a partir de cèl·lules mare pluripotents humanes

Temes Desenvolupament del sistema nerviós Neurogènesi Models neurològics Diferenciació de cèl·lules mare Resum El desenvolupament del cervell humà presenta diversos aspectes singulars, com ara una major complexitat i l’expansió de la producció neuronal, que s’han demostrat difícils d’estudiar en organismes model. Com a resultat

Erratum: anàlisi de partícules teterades d'ADN circular supercapsulat mitjançant nanses de l'àcid nucleic peptídic

Erratum: anàlisi de partícules teterades d'ADN circular supercapsulat mitjançant nanses de l'àcid nucleic peptídic

L'article original es va publicar el 21 d'agost de 2014 Nat. Protoc. 9 , 2206–2223 (2014); doi: 10.1038 / nprot.2014.152; publicat en línia el 21 d’agost de 2014; corregit després de la impressió el 12 de setembre de 2014 En la versió d’aquest article publicat inicialment, la font per a la qual s’adaptaven les figures 2, 4, 8 i 9 no es citava i s’acreditava correctament. S'ha cor

Anàlisi exhaustiva dels fagòcits mononuclears de la retina del ratolí

Anàlisi exhaustiva dels fagòcits mononuclears de la retina del ratolí

Temes Neuroimmunologia Retina Resum El sistema immune innat està activat en diversos trastorns degeneratius i inflamatoris de la retina, com ara la degeneració macular relacionada amb l'edat (AMD). Les microglia retiniana, els macròfags coroïdals i els monòcits reclutats, denominats col·lectivament "fagocits mononuclears de la retina", són determinants crítics del resultat de la malaltia ocular. Moltes

Desenvolupament, validació i implementació d'afinitats metàl·liques immobilitzades per a assajos de cribratge de gran rendiment basats en IMAP per a biblioteques de compostos de baix pes

Desenvolupament, validació i implementació d'afinitats metàl·liques immobilitzades per a assajos de cribratge de gran rendiment basats en IMAP per a biblioteques de compostos de baix pes

Resum Aquest protocol descriu el desenvolupament de proves, la validació i la implementació d'afinitats metàl·liques immobilitzades automatitzades per a assaigs de filtració de fluorescència (FP) basats en les fosfoquímiques (IMAP) i la transferència de ressonància de fluorescència (TR-FRET) de gran rendiment a través de proves de detecció (HTS). Inhibidors

Rectificant: nanocatalitzadors basats en cobalt per a processos d’oxidació i hidrogenació verda

Rectificant: nanocatalitzadors basats en cobalt per a processos d’oxidació i hidrogenació verda

L'article original es va publicar el 21 de maig de 2015 Nat. Protoc. 10 , 916–926 (2015); publicat en línia el 21 de maig de 2015; corregit després de la impressió el 16 de setembre de 2015 A la versió d’aquest article publicat inicialment, el quadre 1 tenia el títol incorrecte; el títol correcte és "Experiments de reciclatge de catalitzadors amb nitrobenzen: 30 h". S'ha