Paper de la cyp2b6 humana polimorfa en la bioactivació de ciclofosfamides | la revista farmacogenòmica

Paper de la cyp2b6 humana polimorfa en la bioactivació de ciclofosfamides | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

El paper de CYP2B6 polimòrfic en la bioactivació de ciclofosfamida (CPA) es va investigar en microsomes de fetge humà. Es van genotipar per primera vegada 67 exemplars de fetge humà respecte dels al·lels variant CYP2B6 * 5 i CYP2B6 * 6. Els nivells d'apoproteïna CYP2B6 en 55 preparacions microsòmiques hepàtiques es van avaluar mitjançant immunoblot. El 4-Hydroxy-CPA i hydroxy-bupropion es van quantificar mitjançant HPLC i LC-MS, respectivament. L'activitat de la O -deetilasa de 7-etoxi-4-trifluormetil-cumarina es va mesurar fluoromètricament. Les freqüències dels al·lels mutants CYP2B6 * 5 i CYP2B6 * 6 van ser del 9, 0 i del 16, 4%, respectivament. L'expressió de proteïna CYP2B6 es va detectar en el 80% de les mostres, amb una gran variació (0, 003-2234, unitats arbitràries). Hi va haver una alta correlació entre el contingut d'apoproteïna de CYP2B6 i 4-hidroxilació CPA ( n = 55, r = 0, 81, P <0, 0001). Quan es basen en els nivells d'apoproteïna CYP2B6, els portadors * 6 tenien una hidroxilació de CPA 4 significativament més elevada ( P <0.05). La hidroxilació 4 de CPA també es va correlacionar significativament amb altres reaccions específiques de CYP2B6 ( n = 20, P <0, 0001). V max i Km per CPA 4-hidroxilació en enzim CYP2B6 recombinant eren 338 nmol / min / nmol i 1, 4 mM, respectivament. El CYP2B6 va mostrar un clearance intrínsec in vitro molt superior al que s'havia observat anteriorment en les variants recombinants CYP2C19 i CYP2C9 en el sistema d'expressió de llevats. Els nostres resultats demostren que la polimorfa CYP2B6 és un enzim important en la bioactivació de CPA. A més, es va identificar un fort impacte de CYP2B6 * 6 en la hidroxilació CPA 4.

INTRODUCCIÓ

La superfamília del citocrom P 450 (CYP) té un paper considerable en el metabolisme d’una gran varietat de xenobiòtics i endobiòtics. CYP2B6 hepàtic humà, inicialment pensat que constitueix una petita fracció del P 450 1 hepàtic total i expressat a un nivell baix, el 2, 3 ha guanyat més atenció en els darrers anys. Els nivells de CYP2B6 han estat menystinguts a causa de la mala selectivitat i sensibilitat dels anticossos usats anteriorment per detectar la proteïna CYP2B6. La nova caracterització de CYP2B6 va revelar nivells de mRNA i proteïnes més alts dels observats anteriorment. 5, 6, 7 Mentrestant, s’han reconegut diverses classes estructuralment diverses de fàrmacs d’ús freqüent com a substrats CYP2B6: ciclofosfamida (CPA), 8 7-etoxi-4-trifluorometilcumarina, 9 bupropió, 10 ifospamida, 8, 11, 12 nicotina, 13 lidocaïna, 14 S-mefenitoïna, 15 verapamil, 14 amitriptilina, 4 diazepam, 16 7-benziloxirosorufin, 16 nevirapina, 4 S-mefobarbital, 17 artemisinina, 18 i propofol 19 .

La variació interindividual en l’activitat i l’expressió de CYP2B6 és extensa. 1, 2, 3 D’acord amb això, el metabolisme dels substrats CYP2B6 també es troba amb grans variacions interindividuals. 4, 9, 20 Es va considerar que part de la variació va ser causada per fenòmens reguladors a nivell transcripcional o translacional. 5, 21, 22 Posteriorment, es va descobrir un polimorfisme genètic d’aquest enzim 23, 24 i això contribueix a la variació. Es va descriure una substitució d'aminoàcids, Gln 172 His, causada per la SN5 G516T ( CYP2B6 * 6 ) que millora l'activitat de 7-etoxicomarin O -deetilasa. Actualment s’han identificat un total de nou mutacions puntuals, de les quals cinc tenen com a resultat substitucions d’aminoàcids als exons 1, 4, 5 i 9, i la resta són mutacions silencioses. Es va trobar que 24 operadors de la variant C1459T (CYP2B6 * 5) presentaven una activitat significativament inferior a la S -mifenitoína N- demetilasa. 24

CPA és un medicament alquilant àmpliament utilitzat en quimioteràpia i immunosupressió contra el càncer. S'ha observat un alt grau de variació interpatient en els paràmetres farmacocinètics de CPA i el seu metabolit actiu 4-hidroxilat (4-OH-CPA). 25, 26 Aquesta variació pot tenir conseqüències en el resultat de la teràpia amb CPA que és un substrat de CYP2B6. Addicionalment, els CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 i CYP2A6 també han estat identificats com a enzims implicats en la formació de 4-OH-CPA. 6, 8, 11, 27, 28, 29 No obstant això, no s’ha avaluat la importància del polimorfisme CYP2B6 en l’activació de CPA.

L’objectiu del present estudi va ser determinar el paper específic del polimorfisme CYP2B6 en l’expressió de proteïnes i la formació de 4-OH-CPA en microsomes hepàtics humans (HLMs). La formació de 4-OH-CPA també es va comparar amb 7-etoxi-4-trifluormetil-cumarina (7-EFC) O-desetilació i hidroxilació de bupropió, que són catalitzades per CYP2B6.

MÈTODES

Genotipat de CYP2B6

L’ADN genòmic es va aïllar de 67 exemplars hepàtics del banc de fetge establert al Departament de Farmacologia Clínica de l’Hospital Universitari Huddinge tal com s’ha descrit anteriorment (aprovat per la Comissió d’Ètica). 30, 31 QIAamp ® Kit de preparació d’ADN de teixit (Qiagen, Hilden, Alemanya) es va utilitzar per aïllar l’ADN genòmic. La identificació de la mutació CYP2B6 C1459T ( CYP2B6 * 5 ) es va fer per discriminació al·lèlica amb un assaig de 5'-nucleasa. 32 Es van utilitzar els primers primers: ggccccagaagacatcgat per a endavant i cttccctcagccccttcag per a imprimació inversa (CyberGene AB, Parc de Recerca Novum, Estocolm, Suècia). Dues sondes MGB-TAQMAN 33 específiques (Applied Biosystems, Cheshire, Regne Unit) es van utilitzar per discriminar entre l’al·lel C1459T i el tipus mutant: cagatcCgcttcct específic C, etiquetat amb VIC i un cercador obscur i cagatcTgcttcctg etiquetat amb FAM i T un cercador fosc. Les reaccions van contenir 900 nM primer i revers, i 200 nM de cada sonda mitjançant reactius estàndard Taqman (Applied Biosystems, NJ, EUA). S'han utilitzat condicions predeterminades de PCR per a Taqman (50 ° C × 2 min, 95 ° C × 10 min, (95 ° C × 15 s, 60 ° C × 1 min) × 35 cicles). Els primers (CyberGene AB, Novum Research Park, Estocolm, Suècia) utilitzats per a l’anàlisi de CYP2B6 * 6 van ser els descrits per Ariyoshi et al. 23 La reacció en cadena de la polimerasa (PCR) es va realitzar en un volum total de 25 µl, incloent 50 ng d’ADN genòmic, 1 × tampó PCR II (Perkin-Elmer, Foster City, CA, EUA), 1, 5 mM MgCl 2, 0, 2 mM dNTP barreja, 500 nM de cada imprimació i 0, 2 U d'ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer, Foster City, Ca, EUA). Després de 3 min de desnaturalització a 94 ° C, les mostres van ser sotmeses al següent programa d’amplificació: desnaturalització a 95 ° C durant 30 s, recuperat a 58 ° C durant 30 s, extensió a 72 ° C durant 45 s durant 35 cicles amb un darrer pas prolongat a 72 ° C durant 7 min. Es van carregar alíquotes de 12 µl de producte PCR en una electroforesi en gel d'agarosa al 2% per confirmar una banda específica de 204 pb. El polimorfisme de longitud de fragment de restricció (RFLP) es va realitzar mitjançant la incubació de 10 µl del producte PCR amb l'enzim de restricció Bsr I (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, EUA) a 65 ° C durant la nit. Les mostres digerides van ser sotmeses a electroforesi amb un gel d'agarosa al 2%.

Preparació de microsomes de fetge humà

Es van preparar microsomes a partir de 55 exemplars de fetge sans del banc hepàtic. 30, 31 Excepte tres fetges de donants japoneses, les mostres eren d'origen suec. Els microsomes es van emmagatzemar en tampó de fosfat de potassi (50 mM, pH 7, 4) a -80 ° C fins a la seva utilització. El projecte va ser aprovat pel Comitè d'Ètica de l'Institut Karolinska / Hospital Universitari Huddinge.

Semiquantitat Western blot

Les proteïnes microsòmiques (25 μg) es van desnaturalitzar durant 5 min a 100 ° C en un tampó de solubilització (1% SDS, 17% glicerol, 0, 001%. Blau de bromofenol, 0, 5% β- mercaptoetanol i 0, 1 M Tris-HCl, pH 6, 8) . En total, es van utilitzar 5 μg de proteïna microsòmica de fetge humà per pou per al desenvolupament de fosfatasa alcalina. Els gels també contenien controls positius (0, 005, 0, 02 i 0, 1 pmol de CYP2B6, expressat per ADNc humà CYP2B6, P-255, BD Gentest, Woburn, MA, EUA) i prestigiosos estàndards de pes molecular de gran abast (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Cada gel també contenia una mostra prèviament caracteritzada d’HLM combinats. Les proteïnes es van separar per electroforesi en gel de SDS-poliacrilamida segons Laemmli (8, 7% d’acrilamida en gels de separació) i van funcionar durant 45 min en un Mini-Protean II a 200 V i van ser transferides a membranes de transferència de PolyScreen PVDF (NEN, Boston, EUA) per semidry. es pot filtrar en una cèl·lula semifreda TransBlot ® SD de Bio-Rad (Laboratoris Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) a aproximadament 1, 5 mA / cm 2 durant 50 min en tampó de transferència (base Tris 20 mM, glicina 154 mM, 20% metanol i 0, 1% SDS). Els blots es van bloquejar amb 5% de llet lliure de greixos en tampó (200 mM NaCl, 0, 05% Tween 20 i 50 mM Tris-HCl, pH 7, 4), incubats durant 1 h amb anticossos primaris (AB1283, 1: 2000, Chemicon), rentat i incubat amb anticossos secundaris (fosfatasa alcalina-Antirabbit IgG, 1: 10000, Sigma, St Louis, MO, EUA) durant 2 hores. Els blots van ser desenvolupats per colorant NBT / BCIP i escanejats en mode de reflectància amb el Bio-Rad GS-700. Els volums de banda (intensitat × àrea) es van dividir pel volum de la banda a partir de microsomes combinats i es van utilitzar aquests valors relatius per a correlacions amb l'activitat enzimàtica.

Assaig ciclofosfamida

Els HLM es van incubar amb 0, 25 o 1 mM CPA (Sigma Chemical Co, Estocolm, Suècia) durant 10 min a 37 ° C en un volum total de 0, 5 ml tampó de fosfat de potassi (50 mM) a pH 7, 4 i una concentració proteica d’1 mg / ml. Les reaccions es van acabar amb l’addició de 0, 5 ml d’acetonitril fred al gel. La formació de 4-OH-CPA estava en el rang lineal entre 2 i 15 min i 0, 1 i 2, 0 mg de proteïna microsòmica.

Els microsomes procedents de cèl·lules insectes infectades amb baculovirus que expressen CYP2B6 humans (GENTEST, MA, EUA) corresponents a 10 pmol van ser incubades amb CPA en presència de 1 mM NADPH a 37 ° C durant 15 min en un volum total de 0, 5 ml tampó de fosfat de potassi ( 50 mM) a pH 7, 4. La CPA es va dissoldre en aigua; Es van utilitzar vuit concentracions de 0, 1 a 20 mM. Les reaccions es van acabar amb l’addició de 0, 5 ml d’acetonitril fred al gel. La formació de 4-OH-CPA va ser lineal en un rang de 2-30 min i de 5 a 20 pmol de CYP2B6.

La barreja d'incubació es va vortexar immediatament durant 10 s i després es va centrifugar a 1500 g durant 5 min a 4 ° C. La quantificació del 4-OH-CPA es va realitzar tal com es descriu recentment per Griskevicius et al. 34 El 4-OH-CPA es va estabilitzar afegint àcid clorhídric afegint dansilhidrazona (Sigma Chemical Co., Estocolm, Suècia). La mescla es va vortexar seguida de 5 min d’incubació en un bany d’aigua de 50 ° C. Es va injectar una mostra final de 100 μl al sistema HPLC, consistent en un injector GILSON 234 (Middleton, WI, EUA), un bucle de 200 μl i un sistema de lliurament de dissolvents SHIMADZU LC10AD (Kyoto, Japó). L'espectrofluoròmetre SHIMADZU RF-551 (Kyoto, Japó) es va establir en una longitud d'ona d'excitació de 350 nm i una longitud d'ona d'emissió de 550 nm. El cabal va ser d’1, 5 ml / min. Totes les mostres es van analitzar per duplicat. Es va establir una corba estàndard mitjançant la dissolució de 4-OH-CPA (ASTA Medica, Frankfurt am Main, Alemanya) en aigua a concentracions entre 0, 2 i 55 mM.

Test de bupropió

GlaxoSmithKline (Regne Unit) va proporcionar una bupropió i una hidroxiproponia. Les barreges d’incubació consistien en bupropió (concentració final de 100 μM) (AstraZeneca R&D Södertälje, Estocolm, Suècia) afegida com a solució de 5 ml d’aclòcit en acetonitril, HLMs i tampó fosfat de potassi de 100 mM (pH 7, 4). Es va provar la linealitat amb la concentració i el temps de proteïna amb microsomes hepàtics combinats. Tots els microsomes individuals es van incubar posteriorment durant 20 min i 0, 4 mg de proteïna microsòmica per mil·lilitre incubació en un volum final de 200 μL. Les mescles es van preincubar durant 10 min a 37 ° C i es va iniciar la reacció mitjançant l’addició de NADPH (concentració final d’1 mM). Les reaccions es van aturar mitjançant l’addició de 100 µL metanol. Les mostres es van centrifugar a 4500 rpm (Rotanta / TR, Hettich, Tuttlingen, Alemanya) durant 10 min a 20 ° C. LC-MS es va analitzar el sobrenedant per determinar la quantitat d’hidroxipropropió. Es van preparar els estàndards afegint metabòlits sonda a les barreges d’incubació en blanc.

La cromatografia es va realitzar per injecció de 10 µL de sobrenadant amb un autosampli CTS HTS, mantingut a 4 ° C, (CTC Analytics, Zwingen, Suïssa), en una columna Zorbax Extend C18 (2, 1 × 50 mm, 3, 5 μm, Agilent, Palo Alto, CA, EUA). La fase mòbil va consistir en un gradient lineal del 5 al 75% B (0, 1% d’àcid fòrmic en acetonitril) en A (0, 1% d’àcid fòrmic en aigua) durant 3 min seguit d’un gradient de pas fins al 5% B per l’equilibri durant 2, 2 min. El cabal es va mantenir a 200 μL / min amb una bomba Agilent 1100. El front es va enviar a les deixalles mitjançant una vàlvula de commutació de dues posicions de sis ports (VICI AG, Schenkon, Suïssa). Després d’1 min, l’efluent de columna es dirigia cap a l’espectròmetre de masses sense dividir-se. El detector era una API 3000 equipada amb una font Turbo-Ionspray (Appied Biosystems / MDS Sciex, Concorde, Canadà) i les dades es van avaluar amb el programari MDS Sciex Analyst 1.1.

Ensenyament de cumarina de 7-etoxi-4-trifluormetil

Els microsomes (0, 1 mg / ml) es van barrejar amb 7-EFC (Sigma, MO, EUA), es van dissoldre en acetonitril (5 μM 7-EFC i 0, 1% acetonitril, concentracions finals) i 50 mM tampó fosfat de potassi (pH 7, 4). Després de 5 min preincubacions a 37 ° C, les reaccions es van iniciar amb NADPH (concentració final de 0, 4 mM). El volum d’incubació total va ser de 100 µl. La fluorescència es va llegir en un lector de plaques SPECTRAFluor Plus (4.0) (TECAN AG, Hombrechtikon, Suïssa) a una longitud d’ona d’excitació de 405 nm i una longitud d’ona d’emissió de 535 nm. Es va provar la linealitat amb el temps i es van utilitzar lectures de 10 minuts per al càlcul d’activitat.

Mètodes estadístics

STATISTICA 5 (StatSoft, OK, EUA) es va utilitzar per a la comparació de diferents grups genòtics. Si ANOVA unidireccional era significativa ( P <0.05), es va aplicar la prova de diferència menys significativa (LSD) post-hoc. Es va utilitzar l’anàlisi de regressió lineal per a les correlacions. P <0, 05 es va acceptar com a estadísticament significatiu. Les dades cinètiques es van aplicar al model cinètic de Michaelis – Menten (un enzim) a GraFit 4.03 (Erithacus Software Limited, Surrey, Regne Unit), un programa d’ajustament de corbes basat en l’anàlisi de regressió no lineal en què K m, V max i la depuració intrínseca ( V màx / K m ) es podria determinar.

RESULTATS

Genotip CYP2B6

Es va analitzar un biobanc de 67 HLMs per als polimorfismes de nucleòtids únics a l’exó 4 (G516T, Gln 172 His) i a l’exó 9 (C1459T, Arg 487 Cys) de CYP2B6 . Els resultats del genotipat CYP2B6 i la freqüència dels al·lels de tipus 1 salvatge i els al·lels de la variant * 5 (C1459T) i * 6 (G516T) es presenten a la taula 1. Els al·lels variants * 5 i * 6 es van trobar a freqüències de 9, 0 i 16, 4. %, respectivament. Es van identificar quatre homozigots * 6 * 6 (6%). Es va trobar un total d'11 (16, 4%) i 13 (19, 4%) de les mostres que eren heterozigots * 1 * 5 i * 1 * 6 , respectivament. Un subjecte que havia investigat les mutacions va ser classificat com a * 5 * 6 o * 1 * 7 ( CYP2B6 * 7 es va definir com a ambdues mutacions en un sol al·lel) genotip.

Taula completa

Expressió d'apoproteïna CYP2B6

El nivell d’expressió d’apoproteïna CYP2B6 es va identificar en 55 dels microsomes del fetge humà i es va presentar en unitats arbitràries de valors immunodetectats (Figura 1). Es va demostrar una variabilitat extrema (rang, 0, 003-2, 234) en els nivells de proteïna CYP2B6. En comparació dels nivells d’expressió CYP2B6 en diferents genotips, es va trobar una tendència de nivell proteic inferior al grup * 6 ( P = 0, 11, * 6 en comparació amb els portadors no * 6 , figura 1). L’expressió de proteïna CYP2B6 era indetectable en 11 de cada 55 HLMs (taula 2). Tot i que la proporció de tenir mostres de proteïna no detectables en cada grup genotip no era significativament diferent, es va observar una tendència, indicant que els portadors de la variant * 6 tenien una absència relativament superior d’expressió de proteïna detectable ( P = 0.16, entre * 6 i no * * 6 operadors, taula 2).

Image

Expressió de proteïna CYP2B6 en diferents grups genòtics. * 6 en comparació amb operadors no * * 6, P = 0, 11.

Imatge a mida completa

Taula completa

4-hidroxilació CPA en HLMs

No es va observar cap diferència significativa en la hidroxilació de CPA 4 entre els grups genòtics ( P = 0.4, ANOVA, figura 2a). Tot i això, quan la hidroxilació CPA 4 es va basar en els nivells d'apoproteïna CYP2B6 (després de l'assignació de totes les mostres no detectables al menor valor detectable), l'activitat en mostres homozigoses o heterozigotes per a l'al·lel * 6 era significativament superior ( P <0, 001, ANOVA) que per a les mostres de * 1 * 1 (taula 3 i figura 2b). Aparentment, la proteïna Gln 172 His (CYP2B6.6) tenia una capacitat catalítica dramàticament superior en comparació amb les altres variants. Fins i tot la proteïna CYP2B6.1.6 codificada amb al·lels G516T presentava una activitat d’hidroxilació de CPA significativament superior, en comparació amb els portadors no * * 6 ( P <0.05, taula 3). Com que hem sobreestimat el nivell de proteïna CYP2B6 en la majoria dels subjectes * 6 * 6 , la capacitat d’activació de CPA específica real d’aquestes mostres seria encara més elevada.

Image

(a) 4-hidroxilació CPA (1 mM) en grups genòtics diferents ( P = 0, 4). (b) 4-hidroxilació CPA (1 mM) ajustada per proteïna CYP2B6 en diferents grups genòtics.

Imatge a mida completa

Taula completa

Correlacions

En una sèrie de 55 HLMs, la correlació entre el nivell d'apoproteïna CYP2B6 i la hidroxilació 4 de CPA era altament significativa ( r = 0, 81, P <0, 0001). Al grup heterozigot * 6 ( n = 12), la correlació era encara més pronunciada ( r = 0, 90, P <0, 0001) que la correlació del grup de tipus salvatge ( r = 0, 75, P <0, 0001, n = 30). També es va trobar una alta correlació entre el contingut d'apoproteïna CYP2B6 i l'activitat de CYP2B6 en 20 HLMs utilitzant 7-EFC ( r = 0, 94, P <0, 0001) i bupropió ( r = 0, 93, P <0, 0001) com a substrats de sonda (figura 3a). Els nivells d'apoproteïna CYP2B6 també es correlacionen significativament amb la hidroxilació 4 de CPA ( r = 0, 84, P <0, 0001, n = 20). També es van demostrar correlacions altament significatives entre la 4-hidroxilació CPA i les altres reaccions específiques de CYP2B6 (7-EFC i hidroxilació de bupropió) (figura 3b). Les correlacions entre la taxa de formació de 4-OH-CPA i l’activitat enzimàtica d’altres isoformes CYP (dades de Tybring et al. , 2002, en manuscrit) també es van avaluar en 19 HLMs (taula 4). La hidroxilació CPA també va mostrar una correlació significativa amb l’activitat CYP3A4 i CYP2C8, però amb un valor r relativament inferior.

Image

(a) Correlacions entre la proteïna CYP2B6 i la hidroxilació 4 de CPA, la hidroxilació de bupropió i l'activitat de 7-EFC. Cap de les fetges donants no va estar exposada a cap inhibidor o inhibidor de CYP2B6. N = 20. (b) Correlacions entre l'activitat de 4-hidroxilació CPA, hidroxilació de bupropió i l'activitat de 7-EFC. Cap de les fetges donants no va estar exposada a cap inhibidor o inhibidor de CYP2B6. N = 20.

Imatge a mida completa

Taula completa

Cinètica d’enzims

Es va realitzar l’anàlisi cinètica de la formació de 4-OH-CPA a les cèl·lules d’insectes infectades amb baculovirus que expressen CYP2B6 + b5 humans. Els paràmetres cinètics aparents per a aquestes reaccions es van determinar mitjançant cinètica enzimàtica en estat estacionari (figura 4). A partir de dos experiments independents, V max i K m van ser de 329–348 nmol / min / nmol CYP i 1, 36–1, 42 mM, respectivament. L'eficiència catalítica mitjana de CYP2B6, segons es calcula a partir del clearance intrínsec in vitro ( V max / K m ), va ser de 243–245 μl / min / nmol CYP.

Image

Michaelis – Menten i Lineweaver – Parcel·la de Burke de formació de 4-hidroxi-CPA al sistema supersom del CYP2B6 + b5 expressat amb baculovirus.

Imatge a mida completa

DISCUSSIÓ

En el present estudi, en un nombre força elevat d’exemplars de fetge humà, vam establir que CYP2B6 és un enzim important en la bioactivació de CPA. Primer, en els nostres 20 preparats microsòmics del fetge humà, hi va haver una forta correlació entre 4-hidroxilació de CPA i altres reaccions que es consideraven específiques per a CYP2B6. Com era d'esperar, no es va observar aquesta correlació entre les reaccions dependents de la hidroxilació de CPA 4 i les depenents de CYP2C9 o CYP2C19. També es va mostrar una correlació significativa entre l'activitat de 4-hidroxilació CPA i l'activitat de CYP2C8 i CYP3A4, però a un nivell considerablement inferior en termes de valor P - i r-. En segon lloc, dins de diversos genotips, hi va haver una correlació significativa entre els nivells d'apoproteïna de CYP2B6 i la hidroxilació 4 de CPA. En tercer lloc, les anàlisis cinètiques enzimàques van apuntar a més un paper dominant de CYP2B6 en la bioactivació de CPA. En comparació dels aparents V max / K m en enzims recombinants, CYP2B6 va mostrar un clearance intrínsec in vitro molt superior al reportat anteriorment per a les variants recombinants CYP2C9 i CYP2C19. 6, 29 En aquesta comparació, però, cal tenir en compte la diferent eficàcia en els dos tipus de sistemes enzimàtics recombinants: el sistema cel·lular d’insectes infectat amb baculovirus que expressa CYP2B6 + b5 humà, i el sistema expressat en llevats per a variants CYP2C9 i CYP2C19. 1.

El CPA és un produt, que requereix una biotransformació hepàtica mitjançant els enzims del citocrom P 450 per exercir el seu efecte. 35 diversos enzims CYP poden catalitzar 4-hidroxilació CPA in vitro , incloent CYP2A6, 8 CYP2B6, 8, 6, 11 CYP2C, 11, 28, 29 i CYP3A4. 6, 8, 28 Els informes sobre la contribució important de CYPs específics a la bioactivació de CPA són contradictoris. Ren et al. Van denunciar un paper de CYP2C9 . 28 També s'ha demostrat que CYP2C9 i CYP2C19 operen a valors relativament baixos de K m en l'activació de CPA i que CPA s'activa de manera diferent per variants al·lèliques de CYP2C9 i CYP2C19. 29 Altres investigadors també han identificat CYP2B6 com a catalitzador clau. 6, 8 En estudis clínics, es va demostrar que la trietiletanetofosforamida inhibeix la conversió de CPA en 4-OH-CPA i, per tant, no es recomana juntament amb CPA. 36 Un altre estudi va confirmar que la trietiletanetofosforamida és un inhibidor específic de CYP2B6, sense cap efecte significatiu sobre l’activitat de CYP2C8 o CYP3A4. 37 En el nostre estudi, la importància de CYP2B6 per a la bioactivació de CPA es demostra ara amb altres enfocaments metodològics.

El present estudi es va trobar amb una freqüència del 16, 4% * 6 al·lel. Si es compara els intervals de confiança del 95%, es troba en el mateix rang que es va reportar en una població japonesa (19, 9%, n = 88) 23 i una població alemanya (28, 6%, n = 215). A més, per als portadors de * 6 es va observar una tendència de disminució del nivell de proteïnes CYP2B6 (Figura 1) i una tendència de proporció relativament més elevada de tenir proteïna no detectable (taula 2). Això demostra l’impacte de l’al·lel * 6 en l’expressió de proteïnes CYP2B6.

Una altra troballa important va ser la capacitat catalítica de CYP2B6.6 notablement millorada en la hidroxilació CPA 4. Els fetges utilitzats en el nostre estudi es van genotipar pel que fa a CYP2C9 * 2, CYP2C9 * 3, CYP2C19 * 2 i CYP2C19 * 3 . Entre els quatre fetges CYP2B6 * 6 * 6, un era CYP2C9 * 1 * 3 i un altre, CYP2C19 * 1 * 2. A més, s'ha investigat a fons el nostre laboratori l'impacte de la polimorfa CYP2C9 i CYP2C19 en la bioactivació de CPA (Griskevicius et al , 2002, en manuscrit). Al material bancari del nostre fetge de 19 exemplars, no es va poder observar cap correlació significativa entre l’activitat de CYP2C9 o CYP2C19 i el metabolisme de CPA (dades mostrades a la taula 4). Per tant, l’alta activitat dels fetges CYP2B6 * 6 * 6 no està relacionada amb els polimorfismes CYP2C9 i CYP2C19.

Els nostres resultats van estar d’acord amb l’informe d’Ariyoshi et al , 23 que van demostrar que el Gln 172 La seva substitució d’aminoàcids augmentava l’activitat de l’ o -deetilasa de 7-etoxicomarina. Es postula que un reemplaçament neutre d’aminoàcids pot alterar la topologia del lloc actiu i, per tant, s’obté un caràcter de cooperativitat homotròpica. La nostra observació recolza aquesta hipòtesi. Aquesta informació podria tenir implicacions clíniques en pacients tractats amb CPA.

No hi va haver cap diferència entre els grups genòtics en la 4-hidroxilació general. Tot i això, els temes que hem estudiat provenien de fetges de donants sans, que poden ser una situació diferent de la de pacients clínics. Segons es va informar recentment, CYP2B6 és induït per molts agents. 4, 38, 39 Teòricament, els agents inductors del CYP dirigits al CYP2B6 es podrien utilitzar en pacients amb càncer per millorar l'activació i l'eficàcia terapèutica de fàrmacs. Atès que el CPA té un efecte d’autoinducció, l’administració contínua d’aquest medicament antitumoral 21, 39 també pot proporcionar un benefici terapèutic, particularment en pacients homozigots o heterozigots CYP2B6 * 6 . És possible que en aquestes circumstàncies es disminueixi relativament la generació de subproductes tòxics no desitjats a través de l’altra via inactiva.

Respecte a l'impacte de l'al·lel CYP2B6 * 5 en l'expressió de proteïnes, no hi va haver cap diferència significativa entre els heterozigots mutants * 5 i els tipus salvatges. Aquesta troballa és contradictòria amb el resultat de Lang et al. , 24 en què es va associar una associació significativa entre la mutació de Arg 487 Cys i una expressió de proteïna reduïda. A més, en el present estudi no es va identificar cap diferència en la hidroxilació 4 de CPA entre * 5 heterozyotes i portadors no * * 5 ( P = 0.97). No obstant això, poden ser necessaris altres estudis amb una mida de mostra més gran inclosa l’homozigot * 5 per verificar els nostres resultats.

La nostra variació intersubjecte extrema (0, 003-2, 234) en els nivells d'apoproteïna CYP2B6 es va determinar al nostre banc bancari de 55 HLM, tot i que només el 80% (44/55) de les mostres contenia proteïna detectable. Aquest percentatge és superior als valors reportats anteriorment (43, 3 24, 2 30% 1 ) i similar amb 70, 9 85, 1 80, 7 o 90% 39 . La variació també es pot deure a altres mutacions encara desconegudes o a causa de factors ambientals. Es requereixen estudis posteriors per identificar els mecanismes darrere d’aquest fenomen.

En conclusió, en aquest estudi vam demostrar que el polimòrfic CYP2B6 és un enzim important per a la bioactivació de CPA. A més, es va identificar el fort impacte funcional de CYP2B6 * 6 en la hidroxilació CPA 4, així com la tendència a la reducció de l’expressió proteica en la variant * 6 . Es requereixen més estudis in vivo per determinar l’impacte clínic general dels polimorfismes CYP2B6 en el resultat del tractament amb CPA i la seva bioactivació.

DUALITAT D'INTERÈS

Cap declarat.