La sobreexpressió induïda per l’estrès rnaset2 media l’apoptosi dels melanòcits a través de la via traf2 in vitro | mort i malaltia cel·lular

La sobreexpressió induïda per l’estrès rnaset2 media l’apoptosi dels melanòcits a través de la via traf2 in vitro | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Senyalització cel·lular
  • Patogènesi

Resum

El recent estudi d’associació a tot el genoma va identificar un vincle entre el vitiligo i les variants genètiques del gen ribonucleasa T2 ( RNASET2 ); tanmateix, encara no s'han de determinar els rols funcionals de RNASET2 en la patogènesi del vitiligen o en l'apoptosi de melanòcit. L’estudi actual es va dissenyar per investigar el patró d’expressió relacionat amb el vitiligo de RNASET2 i la seva funció molecular que involucra proteïnes i rutes de senyalització relacionades amb l’apoptosi. Els resultats van mostrar una sobreexpressió de RNASET2 en exemplars d’epidermis de 40 pacients amb vitiligen en comparació amb la procedent de controls sans aparellats. A més, les anàlisis in vitro van indicar que la sobreexpressió de RNASET2 era inductible en melanòcits i queratinòcits humans primaris cultivats per condicions d’estrès, és a dir, exposició a la irradiació ultraviolada, peròxid d’hidrogen i factors inflamatoris, respectivament, i va provocar un augment de l’apoptosi cel·lular mitjançant el tumor. El factor 2 associat al receptor del factor de necrosi (TRAF2) - ruta de les càpsis a través de la interacció física de RNASET2 amb TRAF2. Així, RNASET2 pot contribuir a la patogènesi del vitiligo mitjançant la inhibició de l’expressió TRAF2 i, com a tal, RNASET2 pot representar un objectiu terapèutic potencial del vitiligen.

Principal

El vitiligen es classifica com una malaltia idiopàtica, adquirida i circumscrita, i la prevalença global actual s'estima entre el 0, 5 i el 2%. El símptoma físic principal és la despigmentació irregular de la pell i el cabell subjacent, que es manifesta per una pèrdua de melanòcits epidèrmics en funcionament. 1, 2 Els estudis sobre els mecanismes patògens del vitiligen han caracteritzat el procés de malaltia molecular com a multifactorial i complex, però encara no han identificat el conjunt precís de factors o les seves interaccions dinàmiques que promouen el desenvolupament i la progressió del vitiligen. No obstant això, s'han proposat diverses teories per explicar la patogènesi del vitiligo basada en els descobriments histològics, clínics i etiològics, la més popular de les quals implica autoimmunitat, factors genètics i estrès oxidatiu. Tot i que és probable que el mecanisme real de la malaltia comporti una interacció complexa de múltiples processos; per exemple, els canvis genètics i epigenètics acumulats poden augmentar la sensibilitat dels melanòcits a la lesió o a la destrucció per una irradiació ultraviolada UV, el peròxid d’hidrogen (H 2 O 2 ) i factors inflamatoris (tots ells definits com a factors de risc de vitiligen), també és possible. que les pertorbacions en les vies de senyalització d’apoptosi contribueixen a la pèrdua de melanòcits. 3 En un recent estudi d’associació d’àmbit del genoma (GWAS) de vitiligen generalitzat en una població de Han xinesa, es va identificar el gen que codifica la ribonucleasa T2 (RNASET2) com a factor de risc de malaltia. 4 Les ribonucleases (RNases) són enzims omnipresents i conservats que funcionen en un ampli espectre de processos fisiològics normals, com ara les respostes immunes d’hoste. Com a tal, les pertorbacions en els seus perfils d’expressió s’han associat a diverses patologies patològiques, incloent càncers i malalties autoimmunes. Els estudis per determinar el paper de RNASET2 en els càncers han diluït els seus efectes supressius -independentment de la seva activitat nucleasa- sobre el creixement cel·lular i el potencial metastàtic, tant in vitro com in vivo . 5, 6, 7 Fins ara, RNASET2 és l’únic membre de la família Rh / T2 / S de la hidrolasa àcida identificada en humans, 8 estudis més recents de l’ortòleg RNASET2 en Saccharomyces cerevisiae , Rny1, han demostrat una funció similar, a que Rny1 pot mediar la inhibició del creixement cel·lular en resposta a les condicions d’estrès oxidatiu i que aquesta activitat és independent de l’activitat catalítica de l’enzim. 9

En l’ anàlisi silico de la seqüència d’aminoàcids RNASET2 es va identificar un motiu d’enquadernació putativa del factor 2 associat al receptor del factor de necrosi tumoral (TRAF2), 10 que recentment s’ha reconegut com a factor determinant del llindar de l’apoptosi a través de les seves activitats de la ubiquitina lligasa que actuen sobre la caspasa 8. Aquesta troballa resulta particularment intrigant quan es considera en el context de les dades d’histologia clínica i de laboratori de teixits afectats pel vitiligo que han demostrat apoptosi, més que la mort cel·lular, és responsable de la pèrdua de melanòcits. Per tant, es va postular que la interacció de TRAF2 i RNASET2 pot contribuir a la patogènesi del vitiligo en humans, possiblement pertorbant el mecanisme d’apoptosi en les cèl·lules implicades (melanòcits i queratinòcits).

A continuació, es descriu el nostre estudi mitjançant mètodes in vitro per determinar el patró d’expressió relacionat amb el vitiligo de RNASET2 mitjançant exemplars de pacients i teixits saludables de donants de control coincident, i per descobrir el mecanisme molecular que implica RNASET2 mitjançant la via de senyalització TRAF2-caspasa d’apoptosi mitjançant cultius melanòcits epidèrmics humans primaris (HEMs) i queratinòcits (HEKs).

Resultats

L'epidermis de vitiligen ha millorat significativament l'expressió de RNASET2

Per investigar la implicació funcional del factor de risc RNASET2 detectat per GWAS en la patogènesi de vitiligo, es va detectar l'expressió diferencial de RNASET2 entre els teixits de lesió de pacients amb vitiligen ( n = 40) i els teixits sans de donants ( n = 40) mitjançant transcripció inversa quantitativa PCR (qRT-PCR) i western blotting. Tant la transcripció (vitiligo versus control: 4, 056 ± 1, 115 contra 1, 034 ± 0, 166; P <0, 001) com les expressions de proteïnes de RNASET2 es van trobar significativament més elevades en els exemplars d'epidermis de vitiligo (figures 1a i b). L’anàlisi immunohistoquímica dels exemplars d’epidermis de vitiligo va mostrar una forta tinció citoplasmàtica de RNASET2 i la tinció en teixits sans va ser significativament menor (figura 1c).

Image

RNASET2 està sobreexpressat en exemplars clínics de lesions epitelials de pacients amb vitiligen. ( a ) Expressió d'ARNm RNASET2 en 40 exemplars de vitiligo i 40 teixits sans detectats per qRT-PCR i representats com a mitjana ± SD a partir de tres experiments independents. * P <0, 01. ( b ) Expressió de proteïna RNASET2 en dos exemplars representatius de vitiligo i un exemplar saludable detectats per taquilla occidental. ( c ) Expressió de proteïna RNASET2 en teixits representatius saludables i vitiligo detectats per immunohistoquímica. Ampliació: × 400

Imatge a mida completa

Les condicions d’estrès indueixen una major expressió de RNASET2 en HEKs i HEMs

Per investigar si l'estrès era un mecanisme potencial de la millora observada de l'expressió de RNASET2 en les lesions epidèrmiques de vitiligo, es van examinar in vitro els efectes de la irradiació UV, H 2 O 2 i factors inflamatoris en els HEKs i HEMs. Les tres condicions d’estrès van induir l’expressió RNASET2 (tant de transcripció com de proteïna) de forma dependent de la concentració (Figures 2 i 3). L’anàlisi d’immunofluorescència també va mostrar increments depenents de la concentració de la quantitat i dispersió de RNASET2 des del citoplasma a la membrana cel·lular i al cultiu sobrenadant (indicant secretat a l’espai extracel·lular); en canvi, els HEKs i HEM control en condicions de no estrès van mostrar els nivells més alts de RNASET2 a la regió citoplasmàtica més propera al nucli (Figures 2g i 3g).

Image

Expressió RNASET2 induïda per l'estrès en HEKs. ( a i b ) Irradiació UV excessiva. ( c i d ) H 2 O 2 . ( e i f ) LPS. ( a, c, i e ) Parcel·les d'expressió d'ARNm normalitzades amb β-actina RNASET2 detectades per qRT-PCR després de 24 h en condicions d'estrès. Les dades s’expressen com la mitjana ± SD dels valors de tres experiments independents. # P <0.05, * P <0.01 versus grup de control, ANOVA d'un sol sentit amb la prova de comparació múltiple de Dunnett. ( b, d, i f ) Detecció de blot occidental de l’expressió de proteïna RNASET2 després de 48 h en condicions d’estrès. ( g ) Detecció indirecta d’immunofluorescència de l’expressió de proteïna RNASET2 en HEKs després de 48 h en condicions d’estrès. Ampliació: × 200. Els experiments de blot occidental i immunofluorescència es van repetir almenys tres vegades i es mostren resultats representatius

Imatge a mida completa

Image

Expressió RNASET2 induïda per l'estrès en HEMs. ( a i b ) Irradiació UV excessiva. ( c i d ) H 2 O 2 . ( e i f ) LPS. ( a, c, i e ) Parcel·les d'expressió d'ARNm normalitzades amb β-actina RNASET2 detectades per qRT-PCR després de 24 h en condicions d'estrès. Les dades s’expressen com la mitjana ± SD dels valors de tres experiments independents. # P <0.05, * P <0.01 versus grup de control, ANOVA d'un sol sentit amb la prova de comparació múltiple de Dunnett. ( b, d, i f ) Detecció de blot occidental de l’expressió de proteïna RNASET2 després de 48 h en condicions d’estrès. ( g ) Detecció indirecta d’immunofluorescència de l’expressió de proteïna RNASET2 en HEKs després de 48 h en condicions d’estrès. Ampliació: × 200. Els experiments de Western blot i immunofluorescència es van repetir almenys tres vegades i es mostren resultats representatius

Imatge a mida completa

Els HEK i els HEM que sobreexpressen RNASET2 són menys viables

Per investigar si la sobreexpressió observada de RNASET2 en les lesions epidèrmiques de vitiligo pot tenir un efecte sobre la supervivència de les cèl·lules endotelials, es va valorar la viabilitat i la naturalesa apoptòtica de HEKs i HEM després de la sobreexpressió de RNASET2 mediada amb lentivirus (figura 4). Els dos tipus de cèl·lules van mostrar una viabilitat reduïda (les figures 4e, f i h) i un augment de l’apoptosi (figures 4g i i) quan RNASET2 va ser sobreexpressat, en comparació amb les cèl·lules transduïdes amb un vector buit. Concretament, el percentatge d'apoptosi cel·lular per a VECTOR vers OE RNASET2 a les cèl·lules HEK (4.167 ± 0, 330 enfront de 23, 467 ± 1, 482; P = 0, 003) i les cèl·lules HEM (5.400 ± 0, 455 contra 27.333 ± 1.053; P = 0, 001) eren significatius estadístics. Per demostrar que efectivament una inducció d'apoptosi en lloc del cicle cel·lular era realment rellevant per a la sobreexpressió de RNASET2, vam realitzar anàlisis del cicle cel·lular dels HEK transfectats i vam trobar que la sobreexpressió de RNASET2 no va provocar una alteració evident del cicle cel·lular (dades no mostrades). A més, incubàvem les cèl·lules HEK i HEM de sobreexpressió RNASET2 en absència o presència de 10 μ M zVAD-fmk, i el percentatge d'apoptosi cel·lular per a OE RNASET2 vers OE RNASET2-10 μ M zVAD en cèl·lules HEK (23.467 ± 1.482 vs. 5.567 ± 0, 713; P = 0, 002) i les cèl·lules HEM (27, 333 ± 1, 053 davant 7.600 ± 0, 980; P = 0, 001) tenien significació estadística (figures 4g i). Els resultats de les anàlisis d’apoptosi i les anàlisis del cicle cel·lular van demostrar que la sobreexpressió de RNASET2 era efectivament rellevant per a l’apoptosi cel·lular.

Image

La sobreexpressió RNASET2 mediada per Lentivirus pertorba el creixement de HEKs i HEMs in vitro . A les 72 hores posteriors a la transfecció, ( a i b ) imatge de HEKs (ampliació: × 100) i HEMs (× 200) transfectades amb vector buit (VECTOR) o vector de sobreexpressió RNASET2 de tipus salvatge (OE RNASET2), i ( c i d ) La sobreexpressió de RNASET2 en HEKs i HEMs confirmada per western blot. Les cèl·lules transfectades es van recollir i sembrar per a més assaigs. ( e i f ) Termes de corbes de creixement al llarg del temps, tal i com s’indica per a HEKs i HEMs. ( g i i ) Anàlisis de HEKs i HEMs sotmesos a apoptosi en absència o presència de 10 μ M zVAD-fmk durant 24 hores el dia 3 després de la sembra. ( e - g i i ) Les dades s'expressen com la mitjana ± SD dels valors de tres experiments independents. ( h ) Es va realitzar un assaig formador de colònies de HEKs el dia 14 després de la sembra. Els experiments es van repetir almenys tres vegades i es mostren resultats representatius

Imatge a mida completa

Els HEK i HEM que sobreexpressen RNASET2 són hipersensibles a l’estrès oxidatiu

Tenint en compte que la sobreexpressió del llevat RNasa RNY1 provoca hipersensibilitat a l’estrès oxidatiu induït per H 2 O 2, es va investigar si RNASET2 té una funció biològica anàloga en la patogènesi del vitiligen. Primer, es van realitzar experiments preliminar-de-dosi (0–100 μ M) i cinètica (1–24 h) i es va obtenir la determinació de les condicions òptimes per a l’estrès oxidatiu, és a dir, HEK: 5 μ M H 2 O 2 durant 24. h i HEM: 0, 5 μ M H 2 O 2 durant 24 h (figures 5a i b). De fet, la sobreexpressió RNASET2 mediada per lentivirus va causar hipersensibilitat de HEKs i HEMs a l’estrès oxidatiu induït per H 2 O 2, com ho demostra la taxa més alta d’apoptosi de les cèl·lules netes (figures 5c i d) i canvis morfològics característics (figures 5e i f) en comparació amb les cèl·lules transduïdes amb vector buit.

Image

Els HEK i HEM que sobreexpressen RNASET2 són hipersensibles a l’estrès oxidatiu. Les cèl·lules transfectades es van recollir i sembrar per a més assaigs. Tots els experiments es van realitzar el dia 3 després de la sembra. ( a i b ) Anàlisis de l'apoptosi amb o sense concentració diferent de H 2 O 2 durant 24 h en HEKs (1, 5 i 10 μ M) i HEMs (0, 1, 0, 5 i 1 μ M). ( c i d ) Comparació de l'apoptosi de cèl·lules netes de a i b induïda per H 2 O 2 en HEKs / HEMs-VECTOR i HEKs / HEMs-OE RNASET2. La prova de t- pair es va utilitzar per determinar la importància de les diferències entre grups. ( e i f ) Canvis en la morfologia cel·lular abans i durant l’estrès oxidatiu. HEKs-VECTOR i HEKs-OE RNASET2 es van observar després d’una exposició de 24 h a 5 μ M H 2 O 2 (a l’esquerra), mentre que HEMs-VECTOR i HEMs-OE RNASET2 es van observar després d’una exposició de 24 h a 0, 5 μ M H 2 O 2 (dreta) Els experiments es van repetir almenys tres vegades; es mostren exemples representatius

Imatge a mida completa

Els HEKs i HEMs que sobreexpressen RNASET2 han reduït la síntesi de melanina

Per investigar més profundament el paper funcional de la RNASET2 en la patogènesi del vitiligo, es van investigar diversos dels factors catalitzadors i de senyalització prèviament identificats relacionats amb el procés de la malaltia en els HEKs i HEMs amb sobreexpressió RNASET2 mediada amb lentivirus. La RNASET2 que sobreexpressa HEK va mostrar una disminució significativa de l’expressió pro-opiomelanocortina (POMC) tant en els nivells de transcripció (figura 6a) com de proteïna (figura 6b). Els HEM que sobreexpressaven RNASET2 mostraven una activitat reduïda de la tirosinasa (TYR) (figura 6c) i la síntesi de melanina (figura 6d).

Image

La sobreexpressió de RNASET2 en HEKs i HEMs comporta una síntesi reduïda de melanina. Les cèl·lules transfectades es van recollir i sembrar per a més assaigs. Tots els experiments es van realitzar el dia 3 després de la sembra. ( a i b ) En HEKs, OE RNASET2 va disminuir significativament l'expressió de POMC detectada per ( a ) qRT-PCR i ( b ) western blotting. ( c - f ) En els HEMs, el OE de RNASET2 va disminuir significativament la síntesi de melanina, tal com es mostra en ( c ) el test d'activitat de TYR i ( d ) la quantificació de melanina. ( e i f ) En HEMs, OE de RNASET2 va disminuir significativament l'expressió de MITF, TYR i TRP-1 tal com van ser detectats per ( e ) qRT-PCR i ( f ) western blotting. Les dades quantitatives es presenten com a mitjana ± SD a partir de tres experiments independents. Els experiments qualitatius es van repetir almenys tres vegades i es mostren resultats representatius

Imatge a mida completa

Per investigar els efectes de la sobreexpressió de RNASET2 en la síntesi de melanina en HEMs, es van detectar els nivells d’expressió dels seus factors clau, el factor de transcripció associat a la microptalmia (MITF), TYR i la proteïna 1 relacionada amb TYR (TRP-1). Tant els nivells de transcripció (figura 6e) com de proteïna (figura 6f) dels tres factors es van restringir significativament en els HEMs que sobreexpressaven RNASET2, en comparació amb els HEM controlats transfectats amb un vector buit. Aquests resultats suggereixen que la sobreexpressió de RNASET2 pot disminuir directament la melanogènesi de HEMs in vitro .

RNASET2 contribueix a la mort cel·lular a través del seu motiu d’unió TRAF2, però independent de la seva activitat catalítica

Per investigar el mecanisme pel qual RNASET2 media la mort cel·lular, es van examinar els efectes de la pertorbació de dos dels seus components relacionats amb la funció, el lloc catalític i el motiu previst de la unió a TRAF2. La pèrdua de viabilitat de les cèl·lules HEK i HEM i l’augment de l’apoptosi observada sobre la sobreexpressió de RNASET2 van ser similars a les observades en la sobreexpressió d’una versió inactiva catalíticament de RNASET2 (Figura 7). Concretament, el percentatge d'apoptosi cel·lular per a VECTOR versus OE de mutant catalitzadament inactiu de RNASET2 (RNASET2-ci) en cèl·lules HEK (4.533 ± 0, 351 enfront de 22, 300 ± 1, 374; P = 0, 001) i HEM (5, 6 ± 0, 748 contra 26, 8333 ± 1, 144; P = 0, 001) tenien significació estadística (figures 7g i h). No obstant això, la sobreexpressió d'una versió mutant del lloc que s'uneix a TRAF2 de RNASET2 no va produir la mateixa viabilitat cel·lular reduïda (figures 7e i f) i alts nivells d'apoptosi tant a les cèl·lules HEK (OE RNASET2-ti enfront a OE RNASET2: 6.367 ± 0, 903 contra 21.667 ± 0, 939; P = 0, 002) i cèl·lules HEM (OE RNASET2-ti vers OE RNASET2: 7, 367 ± 1, 066 contra 27, 267 ± 1, 087; P = 0, 004; Figures 7g i h) com a sobreexpressió RNASET2 de tipus salvatge, cosa que suggereix un paper patològicament rellevant per a la interacció RNASET2 – TRAF2 in vitiligo. Per demostrar més que les cèl·lules que sobreexpressen RNASET2 són hipersensibles a l’estrès oxidatiu mitjançant el seu motiu d’unió TRAF2, però independent de la seva activitat catalítica, vam incubar cèl·lules HEK i HEM transfectades (mutants neo, RNASET2 transfectats o RNASET2 transfectats) amb una concentració òptima de H 2 O 2 com s'ha indicat durant 24 h, i es va trobar que el mutant RNASET2-ti protegia les cèl·lules HEK i HEM de l'apoptosi desencadenada per H 2 O 2, mentre que el mutant RNASET2-ci no. Concretament, els nivells d'apoptosi cel·lular després de l'estrès oxidatiu per OE de RNASET2-ti vers OE de RNASET2 a les cèl·lules HEK (14, 667 ± 0, 710 vers 40, 667 ± 1, 856; P = 0, 001) i les cèl·lules HEM (18, 533 ± 0, 713 contra 54, 900 ± 1, 445; P = 0, 002) eren significatius estadístics (figures 7g i h).

Image

Contribució de l’activitat catalítica i del lloc d’unió a TRAF2 als efectes de creixement cel·lular mediats per la sobreexpressió de RNASET2 en HEKs i HEMs. A les 72 hores posteriors a la transfecció, ( a i b ) imatge de HEKs (ampliació: × 100) i HEMs (× 200) transfectades amb vector buit (VECTOR), vector de sobreexpressió RNASET2 de tipus salvatge (OE RNASET2), catalíticament inactiu RNASET2- vector de sobreexpressió (OE RNASET2-ci), o vector mutant del lloc que uneix TRAF2 RNASET2-sobreexpressant vector (OE RNASET2-ti), i ( c i d ) sobreexpressió RNASET2 en HEKs i HEMs confirmades per Western Blotting. Les cèl·lules transfectades es van recollir i sembrar per a més assaigs. ( e i f ) Termes de corbes de creixement al llarg del temps, tal i com s’indica per a HEKs i HEMs. ( g i h ) Anàlisis d'apoptosi de HEKs amb o sense exposició a 5 μ M H 2 O 2 (esquerra) i HEM amb o sense exposició a 0, 5 μ M H 2 O 2 (dreta) durant 24 h el dia 3 després de la sembra. Les dades s’expressen com la mitjana ± SD dels valors de tres experiments independents. * P <0, 01

Imatge a mida completa

RNASET2 promou l’apoptosi a través de la via TRAF2 – caspasa

La interacció física RNASET2-TRAF2 es va confirmar mitjançant la immunoprecipitació d’un RNASET2 de tipus salvatge marcat amb FLAG mitjançant un anticorp monoclonal anti-TRAF2 (Figura 8a). A continuació, per començar a explorar el mecanisme potencial de la interacció RNASET2-TRAF2, particularment en relació als efectes sobre l’apoptosi cel·lular, es va examinar l’anàlisi Western blot de l’expressió diferencial de TRAF2, caspase-8 i caspase-3 després de la sobreexpressió de RNASET2. Es va trobar que la sobreexpressió RNASET2 induïda amb Lentivirus en HEMs va anar acompanyada per una disminució de l’expressió de TRAF2 i un augment de l’activació proteolítica tant de la caspasa-8 com de la caspasa-3 (figures 8b i c).

Image

RNASET2 promou l’apoptosi a través de la via TRAF2 – caspasa. ( a ) Immunoprecipitació RNASET2 amb TRAF2. pmRFP-TRAF2 es va transfectar en cèl·lules H1299 juntament amb GV287-RNASET2-FLAG (carrils 2 i 4) o sols (carrils 1 i 3). Es mostra la membrana de blot occidental sondada amb un anticòs contra TRAF2 (superior) i contra FLAG (inferior). ( b ) Detecció Western blot de l'expressió TRAF2 i caspase-8 en HEMs. OE de RNASET2 i OE de RNASET2 – ci van produir l’activació proteolítica de la caspasa-8 i d’expressió TRAF2 baixa en comparació amb VECTOR i OE RNASET2-ti. ( c ) Detecció Western blot de l'expressió caspasa-3. ( d ) La contribució hipotètica de la sobreexpressió de proteïnes RNASET2 en la patogènesi del vitiligen. RNASET2 pot afavorir l’apoptosi cel·lular i la hipersensibilització a l’estrès mitjançant la via TRAF2-caspasa

Imatge a mida completa

Discussió

El vitiligo es manifesta en la destrucció progressiva dels melanòcits i té components de susceptibilitat tant en exposicions genètiques com ambientals (és a dir, UV, H 2 O 2 i lipopolisacàrid (LPS)). Tot i haver identificat diversos factors de risc de vitiligen, encara no es coneixen els mecanismes moleculars de la seva complexa patogènesi subjacent. L’estudi actual de RNASET2 proporciona una visió nova dels mecanismes relacionats amb la mort cel·lular i l’apoptosi de cèl·lules epitelials en els teixits afectats.

Les RNases de mamífers comprenen un grup heterogeni d'enzims reguladors implicats en una àmplia gamma de processos biològics normals, incloent l'expressió gènica i la diferenciació cel·lular. RNASET2 és un membre relativament recentment reconegut de la família de RNases Rh / T2 / S; com a tal, les dades aquí presentades no només revelen una nova xarxa patògena de vitiligen, sinó que també fan avançar la comprensió de les propietats biològiques generals de RNASET2.

En particular, l'estudi actual va proporcionar evidència clínicament rellevant de la sobreexpressió de RNASET2 en lesions de vitiligen humà, en comparació amb el teixit saludable, i va trobar que les condicions d’estrès ambientals associades al vitiligo poden estimular l’expressió de RNASET2 en melanòcits primaris i queratinocits humans cultivats. En particular, aquestes condicions d’estrès in vitro semblen estimular també un moviment dinàmic de RNASET2 des de la regió perinuclear a la membrana cel·lular i cap a l’espai extracel·lular (dades no mostrades); Aquests resultats són preliminars i es preveu que les investigacions detallades en curs confirmen fins a quin punt aquest perfil dinàmic es paral·lel que es va demostrar anteriorment per a l’ortòleg de llevats de RNASET2, Rny1p. 8 Un estudi recent va demostrar que la sobreexpressió del RNASET2 humà en els llevats es tradueix en clivatge de tARN i ARNm, i un defecte de creixement. 9 Com que l’ARNt i l’RNA tenen un paper decisiu en el procés de síntesi de proteïnes, la divisió d’ARNt i ARNr a causa de la sobreexpressió de RNASET2 pot comportar trastorns de síntesi de proteïnes. Aquesta podria ser la raó de la manca de correlació entre l'ARNm RNASET2 i l'expressió de proteïnes a la radiació UVB de banda estreta (NB-UVB) de 0, 6 J a les cèl·lules HEK (Figura 2a) i a la radiació NB-UVB de 0, 4 i 0, 5 J a les cèl·lules HEM ( Figura 3b), i a 100 i 200 μ g / ml de LPS a les cèl·lules HEK (figura 2e).

Rny1p ha estat estudiat extensament i s’ha caracteritzat com un interruptor de circuit intracel·lular capaç de controlar el destí cel·lular, independentment de la seva capacitat de clivatge d’ARN citosòlic. 9, 13 L’estudi anterior que va mostrar la translocació induïda per l’estrès oxidatiu de Rny1p del vacúol al citosol també va demostrar que aquest procés dinàmic condueix a l’activació d’una via de senyalització d’apoptosi cel·lular, independent de l’activitat catalítica de l’enzim. Aquesta darrera troballa també es va confirmar en un model de tumor in vivo . En l'estudi actual, es va demostrar que RNASET2 indueix l'apoptosi de melanòcits i queratinòcits primaris humans i que causa hipersensibilitat a l'estrès oxidatiu, independentment de l'activitat catalítica de l'enzim. Aquestes troballes també coincideixen amb les propietats biològiques demostrades per a altres membres de la família RNase T2. 15

L’hormona estimulant de α -melanocit derivat de POMC ( α -MSH) s’expressa al sistema nerviós central i als teixits perifèrics com la pell, amb la seva expressió primària de la pell en queratinòcits. 16 En conseqüència, s'han definit funcions robustes de α- MSH en els processos moleculars de pigmentació de la pell, apoptosi, inflamació i supressió immunitària induïda pels raigs UV. 17, 18 A més, es va demostrar que l'estimulació α- SMH del seu receptor cognat en melanòcits, el receptor de la melanocortina 1, va provocar una inducció de cAMP combinada a la proteïna G, que al seu torn condueix la via CRE-MITF i promou la proliferació cel·lular i la melanina. síntesi. Així, l'expressió de POMC disminuïda de forma significativa observada en RNASET2 que sobreexpressa RNASET2 de l'estudi actual pot representar un vincle directe (o indirecte) amb una mala proliferació de melanòcits i la síntesi de melanina suprimida. El MITF es considera un factor de transcripció reguladora principal dels melanòcits, que regula directament gens específics dels melanòcits com Tyr i Trp-1 (que també estan relacionats amb la síntesi de melanina); Els seus efectes transcripcionals d’ampli abast tenen implicacions en la supervivència cel·lular, la progressió del cicle cel·lular, la migració i la diferenciació. 21 Així, l'expressió significativament disminuïda de Mitf, Tyr i Trp-1 observada en HEMs que sobreexpressen RNASET2 de l'estudi actual pot representar un enllaç directe a la inhibició de RNASET2 de la melanogènesi (figura 8d).

L’apoptosi induïda per la sobreexpressió RNASET2 és una altra característica desconeguda d’aquest enzim. Una anàlisi prèvia de l'estructura RNaseT2 per donar a conèixer els seus rols biològics mitjançant la identificació de llocs funcionals putatius va trobar un motiu d'unió TRAF2 conservat. 10 Com tots sabem, els mecanismes relacionats amb l’apoptosi d’activació de la caspasa estan ben definits, tot i que els mecanismes i els rols funcionals dels modes de desactivació contrarestats encara no estan clars. Un estudi recent va informar que TRAF2 interacciona amb la caspasa-8 en el complex de senyalització que indueix la mort. TRAF2 té una funció crítica en la regulació de l’apoptosi dirigint la poliubiquitinació K48 depenent de RING de la caspasa-8, marcant eficaçment la proteasa per a la degradació proteasomal en autoprocessament i translocació citoplasmàtica. Així, l'esgotament de TRAF2 redueix el llindar del senyal d'apoptosi. 11 En el present estudi, es va observar la descregulació de TRAF2 acompanyada de la sobreexpressió de RNASET2. Com que TRAF2 va establir una barrera crítica per al compromís amb l’apoptosi cel·lular marcant la caspasa-8 activada amb un temporitzador d’aturada K48-ubiquitina, la baixada de la TRAF2 podria disminuir el llindar del senyal d’apoptosi i després l’activació (via clivatge) de la caspasa-3, un efectiu a baix de caspasa-8, es va augmentar en cèl·lules amb sobreexpressió RNASET2 (figura 8d). És possible llavors que la sobreexpressió de RNASET2 pugui promoure l’apoptosi a través de la via TRAF2-caspasa, i aquest procés seria independent de la seva activitat catalítica. Curiosament, els resultats de l'estudi actual demostren que quan es va mutar el lloc d'unió a TRAF2 a RNASET2, es van interrompre els efectes promocionals sobre l'apoptosi. També hem realitzat RNASET2-tico-immunoprecipitació i hem trobat que RNASET2-ti realment no aconsegueixen immunoprecipitar TRAF2 o, òbviament, afebleixen la interacció en comparació amb el tipus ampli RNASET2 (dades no mostrades). Els resultats van demostrar que el mutant RNASET2-ti no pot suportar la unió TRAF2, confirmant així que RNASET2 i TRAF2 interactuen efectivament. Aquests descobriments van servir per verificar la rellevància fisiològica per al lloc TRAF2 previst. Per investigar un mecanisme detallat a baix, hem dissenyat un conjunt d’experiments per a la següent etapa. Confirmarem la interacció específica entre RNASET2 i TRAF2 crític per a la mort cel·lular en un sistema més fisiològic (model de peix zebra) i explorarem els efectes de RNASET2 en TRAF2 (transcripcional, translacional o posttraducional?). Com a importància, la coimmunoprecipitació de RNASET2 i TRAF2 en aquest estudi representa, segons el que sabem, la primera evidència reportada d’una relació entre RNASET2 i TRAF2 en cèl·lules humanes.

A més, l’autoimmunitat també està implicada en la patogènesi del vitiliogo. Estudis recents també van indicar que l’omega-1, un membre de la família RNase T2 segregat dels ous de Schistosoma mansoni , contribueix a la polarització Th2 de les cèl·lules T CD4 + T provocant cèl·lules dendrítiques humanes, 22, 23, deixant entreveure que la RNASET2 humana podria estar implicada en la resposta immune. i, per tant, subratlla la patogènesi del vitiligen.

En resum, l'estudi presentat aquí demostra que la sobreexpressió de proteïna RNASET2 està associada amb vitiligen i que el mecanisme patògens subjacent pot implicar l'estimulació de RNASET2 de l'apoptosi cel·lular i la hipersensibilització a l'estrès mitjançant la via TRAF2-caspasa. Els mecanismes moleculars de RNASET2 descoberts per aquest estudi poden representar característiques manipulables mitjançant les quals es pot millorar la gestió clínica de pacients amb vitiligen.

Glossari

RNASET2

ribonucleasa T2

TRAF2

factor associat a receptor del factor de necrosi tumoral

GWAS

estudi d’associació a tot el genoma

HEM

melanòcit epidèrmic humà primari

HEK

queratinocit epidèrmic humà primari

NB-UVB

banda UVB de banda estreta

H 2 O 2

peròxid d'hidrogen

LPS

lipopolisacàrid

OE

sobreexpressió

RNASET2-ci

mutant catalíticament inactiva de RNASET2

RNASET2-ti

RNASET2 no té el domini d'unió TRAF2

POMC

pro-opiomelanocortina

α- MSH

Hormona estimulant de oman-melanocits

MITF

factor de transcripció associat a la microphtalmia

TYR

tirosinasa

TRP-1

Proteïna-1 relacionada amb el TYR