La teràpia dirigida de la via xiap / proteasoma supera la resistència a la pista en el carcinoma en canviar la senyalització per apoptosi a un mode 'tipus i' independent de bax / bak | mort i malaltia cel·lular

La teràpia dirigida de la via xiap / proteasoma supera la resistència a la pista en el carcinoma en canviar la senyalització per apoptosi a un mode 'tipus i' independent de bax / bak | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Resistència terapèutica contra el càncer
  • Senyalització cel·lular
  • Teràpies dirigides

Resum

TRAIL és un agent anticancerós prometedor, capaç d’induir l’apoptosi en una àmplia gamma de cèl·lules tumorals resistents al tractament. A les cèl·lules del tipus II, el senyal de mort desencadenat per TRAIL requereix amplificació a través de la via d'apoptosi mitocondrial. En conseqüència, la desregulació de la via de senyalització d’apoptosi intrínseca, per exemple, per la pèrdua de Bax i Bak, confereix resistència TRAIL i limita la seva aplicació. Aquí, demostrem que malgrat la resistència de cèl·lules amb doble deficiència de Bax / Bak, el tractament TRAIL va donar lloc a l’activació amb caspasa-8 i el processament complet dels proenzims caspasa-3. No obstant això, la caspasa-3 activa va ser degradada pel proteasoma i no detectable tret que s'inhibís la via XIAP / proteasoma. La inhibició directa o indirecta de XIAP per RNAi, Mitramicina A o per la mimètica SMB LBW-242, així com la inhibició del proteasoma per part de Bortezomib supera la resistència TRAIL de cèl·lules tumorals amb deficiència de Bax / Bak. D'altra banda, l'activació i estabilització de la caspasa-3 s'independitza de la senyalització de la mort mitocondrial, demostrant que la inhibició de la via XIAP / proteasoma supera la resistència convertint cèl·lules del tipus II en tipus I. Els nostres resultats demostren a més que la ubiquitina ligase X3 de la ubiquitina és un portaveu crític per al fenotip del tipus II. La manipulació farmacològica de XIAP és, doncs, una prometedora estratègia per sensibilitzar les cèl·lules de TRAIL i superar la resistència a TRAIL en cas de defectes centrals de la via de senyalització d’apoptosi intrínseca.

Principal

TRAIL (lligant que indueix l’apoptosi relacionada amb el factor de necrosi tumoral / Apo2L) és capaç d’induir la mort cel·lular en una àmplia gamma de càncers resistents a la teràpia convencional sense efectes secundaris aparents tòxics als teixits normals. 1 L'expressió de TRAIL-R1 és un paràmetre pronòstic independent, per exemple, en el carcinoma de còlon i l'expressió alta de TRAIL-R1 es correlaciona amb la supervivència prolongada sense malalties. 2 A més, TRAIL i els lligands de la mort CD95L / FasL i TNF α sensibilitzen les cèl·lules tumorals per a una radiació ionitzant i una apoptosi induïda per fàrmacs 3, 4 encara que els perfils de toxicitat poden dificultar (TNF α ) o fins i tot impedir l'ús clínic (CD95L / FasL).

Els lligands mortals inicien l’oligomerització del receptor i la formació del complex de senyalització que indueix la mort (DISC), donant lloc a l’activació de la caspasa iniciadora 8. En les cèl·lules de tipus I, la caspasa activa 8 media directament una activació suficient de l'efector caspasa-3 que desencadena l'execució d'apoptosi. En canvi, a les cèl·lules del tipus II, el senyal de mort requereix amplificació mitjançant l’activació de la via de mort de les cèl·lules intrínseques a través de la divisió mediada per la caspasa-8 i l’activació de Bid, una proteïna només BH3 de la família Bcl-2. 6

Així, les proteïnes de la família Bcl-2 són reguladors clau de l’apoptosi mitocondrial i de la receptora mortal mediada. Els membres de la família mostren homologia en almenys un dels quatre dominis d’homologia de Bcl-2 (BH). Les proteïnes anti-apoptòtiques d'aquesta família (Bcl-2, Bcl-x L Bcl-w, Mcl-1 i Bfl-1 / A1) es caracteritzen per la presència dels quatre dominis BH. Els membres pro-apoptòtics es poden subdividir en els homòlegs BH123 multidomàniques (Bax i Bak) i les proteïnes de la subfamília només BH3 (Bad, Bim, Puma, Noxa, Nbk / Bik, Bmf, Bnip3, Hrk i Bid). 7

(T) Bota activada, truncada, desencadena l’activació de Bax per induir la permeabilització de la membrana mitocondrial (MMP) acompanyada de l’alliberament de factors apoptogènics de l’espai interm membrana mitocondrial al citosol. Un d’aquests factors, el citocrom c , s’associa amb APAF-1 i pro-caspasa-9 per formar l’apoptosoma, una plataforma que facilita l’activació autocatalítica de la caspasa-9, que al seu torn desencadena les caspases efectores. Un altre factor pro-apoptòtic alliberat amb MMP és SMAC / DIABLO. 8, 9 SMAC potencia l’apoptosi neutralitzant l’inhibidor citosòlic de les proteïnes de l’apoptosi (IAPs). Els IAP, una família de vuit analògics humans incloent cIAP1, cIAP2 i XIAP, aquest últim el més potent, 10 impedeixen l’activació inadvertida de la caspasa XIAP ho fa en unir-se directament a les caspases a través del seu domini IAP (BIR) de baculovirus. Molts tumors humans expressen nivells elevats de PAI incloent XIAP i l'expressió aberrant dels PAI s'ha relacionat amb la resistència a la teràpia i el mal pronòstic. 11 A més de la regulació de XIAP, la desregulació de proteïnes pro i anti-apoptòtiques de la família Bcl-2 és un mecanisme central implicat en la resistència TRAIL. 12, 13 Recentment hem demostrat que la pèrdua de Bax, malgrat l'expressió del seu homòleg Bak, confereix resistència a l'apoptosi induïda per TRAIL. Tanmateix, la inhibició de l'antagonista endogàni de Bak Mcl-1 permet que TRAIL mati les cèl·lules a través de Bak. 14

Aquí, es demostra que la inhibició de la via XIAP / proteasoma fa que les cèl·lules del carcinoma de Bax / Bak siguin dobles amb sensibilitat al TRAIL. Com que en aquestes cèl·lules l’ampliació mitocondrial del senyal del receptor de la mort és impossible, la regulació baixa de XIAP converteix el tipus II en cèl·lules de tipus I. Aquests resultats mostren que en l’apoptosi induïda per TRAIL, XIAP dicta el mode II de mort cel·lular i que canviar el mode de mort cel·lular és una estratègia prometedora per superar la resistència TRAIL en cèl·lules amb defectes centrals en la senyalització d’apoptosi mitocondrial.

Resultats

Per avaluar estratègies per superar la resistència al TRAIL, es va abordar el paper de XIAP en un model de línia de cèl·lules de càncer de còlon HCT116. Es va comparar l’impacte de la regulació descendent de Mcl-1 i XIAP sobre les cèl·lules isogèniques tractades amb TRAIL HCT116 en pes, les cèl·lules amb deficiència de Bax HCT116 (anomenada HCT116 Bax-) i les cèl·lules desproveïdes de Bax i Bak (anomenada HCT Bax – / Bak–). 15 Es va aconseguir una pèrdua específica d’expressió de proteïna mitjançant l’eliminació de bax 16 i la rehabilitació Bak Bak 17 mediada per shRNA i es va verificar mitjançant l’anàlisi Western blot (es poden comparar les figures 1a i c perquè representen les mateixes membranes).

Image

El silenciament de XIAP per interferències de l'ARN permet que TRAIL indueixi la mort de cèl·lules independent de Bax / Bak en cèl·lules de tipus II. Les cèl·lules HCT116 en pes, Bax i Bax- / Bak- es van transfectar amb control-, Mcl-1- o XIAP-siRNA. Després de 24 h, els extractes de proteïna es van preparar i analitzar mitjançant western blot. La regulació descendent de Mcl-1 i XIAP i l'estat d'expressió de Bax i Bak per a les línies de cèl·lules respectives HCT116 es mostren a l'esquerra de ( a - c ). Després es van tractar les cèl·lules amb 50 ng / ml TRAIL, cultivades durant 24 h addicionals i es van determinar cèl·lules apoptòtiques mitjançant la mesura citomètrica de flux del contingut d’ADN cel·lular. ( a ) Les cèl·lules en pes de HCT116 van ser sensibilitzades per l'apoptosi induïda per TRAIL després de la regulació de Mcl-1 o XIAP. ( b ) Mcl-1, així com la regulació descendent XIAP, superen la resistència TRAIL de les cèl·lules Bax HCT116. ( c ) La desregulació de Mcl-1 no supera la resistència TRAIL de les cèl·lules HCT116 Bax- / Bak-. En canvi, la derrota de XIAP permet a TRAIL matar cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bak. Es donen resultats com a valors mitjans ± SD de tres experiments per a les línies cel·lulars respectives a la part dreta de ( a - c )

Imatge a mida completa

Les cèl·lules HCT116 es van transfectar amb control-, Mcl-1- o XIAP-siRNA i es va confirmar la regulació inferior de les respectives proteïnes mitjançant l’anàlisi del blot occidental (figura 1, esquerra). Després de la baixada de Mcl-1 o XIAP, les cèl·lules es van incubar amb 50 ng / ml TRAIL durant 24 h i es va analitzar la inducció de l’apoptosi mitjançant la mesura citomètrica de flux de cèl·lules amb un contingut d’ADN hipodiploide. El tractament amb TRAIL va donar lloc a la fragmentació de l’ADN apoptòtic en prop del 28% de les cèl·lules HCT116 en pes. La sensibilitat cap a TRAIL es va augmentar amb el cop de Mcl-1 i, encara més, per la derrota de XIAP, al voltant del 35 i el 42% de les cèl·lules respectives eren apoptòtiques (figura 1a, dreta).

A diferència de les cèl·lules en pes HCT116, les cèl·lules HCT116 deficients de Bax eren resistents a l’apoptosi induïda per TRAIL. Tot i això, la regulació descendent de Mcl-1 o XIAP va fer que aquestes cèl·lules fossin susceptibles de TRAIL. En comparació amb el 6% de les cèl·lules de control, l’apoptosi induïda per TRAIL va augmentar fins a un 32 i un 41% a la baixada de Mcl-1 o XIAP, respectivament (Figura 1b, dreta).

En canvi, la resistència TRAIL de les cèl·lules Bax-Bak / HCT116 no es va poder superar per inhibició de Mcl-1. Tanmateix, la desregulació de XIAP sensibilitzà fortament aquestes cèl·lules amb doble deficient per a l’apoptosi induïda per TRAIL. Les cèl·lules transfectades amb ARN de control o Mcl-1-si i tractades amb TRAIL mostraven una fragmentació d'ADN apoptòtica en <6% de les cèl·lules, que augmentà fins al 34% després de la desregulació de XIAP (Figura 1c, dreta).

L’annexina V-FITC / iodur de propidium (PI), la tinció de HCT116 en pes i HCT116 Bax / Bak− en el tractament TRAIL va confirmar que la mort cel·lular es produeix per apoptosi i que la resistència TRAIL de les cèl·lules HCT116 Bax- / Bak-es pot superar regulació baixa de XIAP (figura suplementària S1). A més, la regulació XIAP anul·la la resistència de les cèl·lules HCT116 que sobreexpressen Bcl-2 o Bcl-x L, donant suport a la nostra conclusió que al tractament amb TRAIL, les cèl·lules deficients de XIAP moren independentment d’una via regulada amb proteïnes de la família Bcl-2 (figura suplementària S2).

Com que la caspasa-8 i -3 són crucials per a l’apoptosi induïda per TRAIL, es va examinar a continuació fins a quin punt la deficiència de Bax / Bak impacta en el processament de la caspasa-8 i -3. Hem tractat les cèl·lules HCT116 wt i Bax- / Bak-amb TRAIL i hem analitzat el patró de clivatge d’aquestes caspases. Els nivells pro-caspasa-8 i -3 són comparables en ambdues línies cel·lulars, respectivament (figura 2a, esquerra). Després del tractament amb TRAIL, la pro-caspasa-8 s'escindeix en les dues línies cel·lulars i es processa fins a les seves subunitats actives de forma similar. Curiosament, en ambdues línies cel·lulars, l’activació de la caspasa-8 va juntament amb la divisió del zimogen pro-caspasa-3, cosa que indica que l’activació amb caspasa-8 després del tractament TRAIL és suficient per escindir la pro-caspasa-3. No obstant això, la divisió de la pro-caspasa-3 va acompanyada del processament de les seves subunitats p18 / p16 actives només en cèl·lules pesades HCT116 sensibles al TRAIL. En canvi, les cèl·lules Bax-Bak / HCT116 resistents a TRAIL no van mostrar cap processament de la caspasa-3 a les seves subunitats actives (figura 2a, esquerra). Així, en contrast amb la divisió del zimogen pro-caspasa-3, que és independent de Bax i Bak, el processament de la pro-caspasa-3 a les seves subunitats actives es basa en una via mitocondrial intrínseca intacta.

Image

TRAIL indueix el processament pro-caspasa-3 en cèl·lules amb doble deficiència de Bax / Bak, però no supera la inhibició per part de la XIAP i la degradació proteasòmica de la caspasa-3. ( a ) Les cèl·lules HCT116 en pes i Bax-/ Bak-es van tractar amb 50 ng / ml TRAIL i es va analitzar el processament pro-caspasa-8 i -3 mitjançant immunoblot. La divisió de la pro-caspasa-8 i -3 va induir el tractament amb TRAIL a les dues línies cel·lulars. La divisió de la pro-caspasa-8 va acompanyada de la generació de les seves subunitats actives. En canvi, el processament de la pro-caspasa-3 a les seves subunitats actives només es pot detectar en HCT116 en pes, però no en les cèl·lules Bax-/ Bak-HCT116 (a l'esquerra). La regulació addicional de XIAP en combinació amb TRAIL va provocar el processament complet de la pro-caspasa-3 a les seves subunitats actives a les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak-(dreta). ( b ) Les cèl·lules HCT116 en pes i Bax- / Bak-es van incubar amb l'inhibidor del proteasoma MG132 abans del tractament amb TRAIL. Després de la inhibició del proteasoma, el tractament TRAIL va donar lloc a un tractament complet de la pro-caspasa-3 a les seves subunitats actives a les dues línies cel·lulars. ( c, d ) A més de TRAIL, es van tractar les cèl·lules HCT116 en pes i Bax-/ Bak-amb 1 μ M de MG132 ( c ) o amb 1 μ M de bortezomib (BZM) ( d ). Les cèl·lules es van cultivar durant 24 hores, es van collir i es van determinar les cèl·lules apoptòtiques mitjançant la mesura citomètrica de flux del contingut d'ADN cel·lular. Les cèl·lules en pes de HCT116 es van sensibilitzar per l’apoptosi induïda per TRAIL per MG132 o BZM. A més, la inhibició del proteasoma permet a TRAIL matar cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bak

Imatge a mida completa

Per analitzar si l'activitat de la ubiquitina lligasa de XIAP media la degradació de les subunitats de la caspasa-3, vam eliminar XIAP. A les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak-transfectades amb siRNA de control, el tractament TRAIL va donar lloc a una escisió pro-caspasa-3 sense generació de la caspasa activa 3. En canvi, la regulació baixa de XIAP en combinació amb TRAIL va provocar el processament complet de la pro-caspasa-3 a les seves subunitats actives (figura 2a, dreta). Això indica que l'activitat de la caspasa-8 desencadenada per TRAIL és suficient per escindir la pro-caspasa-3 mentre que l'activació de la caspasa-3 s'evita per la degradació mediada per XIAP de la caspasa-3 processada.

Per investigar la degradació proteasomal de la caspasa-3 activa, hem tractat les cèl·lules HCT116 en pes i Bax-/ Bak amb concentracions no tòxiques de l’inhibidor del proteasoma MG132. A les cèl·lules en pes de HCT116, l'activació de la caspasa-3 induïda per TRAIL augmenta després del tractament addicional amb MG132 (figura 2b, esquerra). Més important encara, a les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak-, TRAIL només va induir la divisió de la pro-caspasa-3 sense nivells detectables de subunitats actives, mentre que la combinació va induir el processament complet de la caspasa-3 a les seves subunitats actives (figura 2b, dreta).

D’acord amb l’augment de l’activació de la caspasa-3, l’apoptosi induïda per TRAIL es va incrementar a les cèl·lules HCT116 en pes després de la inhibició addicional del proteasoma. A més, el tractament MG132 va vèncer la resistència TRAIL de les cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bax (figura 2c). Igual que MG132, el bortezomib (BZM), el primer inhibidor terapèutic del proteasoma, va sensibilitzar les cèl·lules HCT116 en pes per a l’apoptosi induïda per TRAIL i va superar la resistència TRAIL de les cèl·lules Bax-Bak / HCT116 (Figura 2d), indicant que la sensibilització cap a l’apoptosi induïda per TRAIL per la inhibició del proteasoma es produeix per l'estabilització de la caspasa-3 activa i no es basa en la via apoptòtica intrínseca.

Per investigar més el mode d’activació de la caspasa-3 en presència o absència de XIAP en relació amb la senyalització d’apoptosi de tipus I / II, es va analitzar l’apoptosi induïda per TRAIL en cèl·lules sotmeses a caspasa-8 i baixada de la licitació. A les cèl·lules en pes de HCT116, l’apoptosi induïda per TRAIL va anar acompanyada del processament pro-caspasa-8, la divisió d’ofertes i el processament de subunitats actives pro-caspasa-3 (figura 3a). La reducció de la caspasa-8 o la inducció d'apoptosi inhibida per Bid. Però, en contraposició a la regulació descendent de la caspasa-8, que va bloquejar la divisió pro-caspasa-3 induïda per TRAIL, la derrota no va afectar la divisió pro-caspasa-3, cosa que indica que la majoria del processament pro-caspasa-3 detectat es produeix aigües amunt del mitocondrial. bucle d’amplificació. No obstant això, tot i que es va escindir la pro-caspasa-3, les subunitats van disminuir després de la baixada de la regulació de l’oferta (figura 3a, dreta), cosa que indica que el processament de la pro-caspasa-3 a les subunitats actives depèn de l’oferta.

Image

Al silenciar XIAP, l’apoptosi induïda per TRAIL i l’activació de la caspasa-3 s’independitzen de Bid, Bax i Bak. ( a ) Les cèl·lules HCT116 en pes van ser transfectades amb ARN de control, caspasa-8 o Bid-siRNA i posteriorment incubades amb TRAIL. La fragmentació de l'ADN induïda per TRAIL es va bloquejar mitjançant la regulació baixa de la caspasa-8 o de la part Bid (a l'esquerra). L’anàlisi de Western blot va confirmar la baixada de les respectives proteïnes (dreta). A més, l'anàlisi de taquilla occidental va demostrar que l'enderroc de la divisió de la caspasa-8 va bloquejar la divisió pro-caspasa-3. En canvi, la derrota de Bid no va inhibir la divisió pro-caspase-3 sinó el processament de la caspasa-3 a les seves subunitats actives. ( b ) Es va tractar HCT116 en pes com a ( a ). A més, XIAP va ser enderrocada. Després de la derrota de XIAP, l’apoptosi induïda per TRAIL va ser inhibida per la baixada de la caspasa-8, però no per la regulació de baixada de l’oferta (a l’esquerra). En aquest entorn, l’activació induïda per TRAIL de la pro-caspasa-3, indicada per la subunitat activa, depèn de la caspasa-8, però era independent de l’oferta. ( c ) Les cèl·lules HCT116 de Bax- / Bak es van tractar com a ( b ). Després de la reducció de XIAP, l’apoptosi induïda per TRAIL (a l’esquerra) va acompanyada d’activació de la caspasa-3 (dreta). Ambdós es poden bloquejar mitjançant la derrota de la caspasa-8. En canvi, l’activació i l’apoptosi de la caspasa-3 no es va veure bloquejada per la baixada regulació de Bid. Així, la inhibició de XIAP permet a TRAIL activar la caspasa-3 i induir l'apoptosi malgrat la pèrdua combinada de Bid, Bax i Bak

Imatge a mida completa

La derrota addicional de XIAP va restablir la inducció de l’apoptosi per TRAIL a les cèl·lules HCT116 en pes amb el knockdown de Bid (figura 3b, a l’esquerra) i va donar lloc a una escisió completa de pro-caspase-8 i pro-caspase-3, acompanyada d’alts nivells de la caspasa p18. -3 subunitat (figura 3b, dreta). Assumpció de la inducció de l’apoptosi amb deteriorament de la caspasa-8, escletxa de l’oferta i escissió de la caspasa-3 en absència o presència de derrocament de XIAP (figures 3a i b). Aquests resultats es van confirmar en les cèl·lules de Bax-Bak / HCT11, en què la regulació de baixada de XIAP supera la resistència a TRAIL (figura 3c, a l’esquerra) i la inducció de l’apoptosi s’acompanya de la divisió pro-caspasa-8 i d’oferta. A més, l'absència de XIAP va facilitar el processament de la pro-caspasa-3 a les subunitats actives (figura 3c, dreta). Aquests esdeveniments van ser inhibits per la derrota de la caspasa-8, però no per la derrota de Bid. Així, la inhibició de XIAP permet a TRAIL activar la caspasa-3 i induir l’apoptosi malgrat la pèrdua combinada de Bid, Bax i Bak, demostrant clarament que la inducció de la mort cel·lular és independent de la via apoptòtica intrínseca i segueix un mode tipus I.

A continuació, vam comparar la regulació depenent del temps de l’apoptosi induïda per TRAIL a HCT116 en pes i a les cèl·lules de Bax / Bak-HCT116 després de la desregulació de XIAP. L’anàlisi Western blot de les cèl·lules pesades HCT116 amb tractament tractat amb TRAIL va revelar un tractament precoç de la caspasa-8, acompanyat de l’activació de Bid, indicat per un augment dels nivells de tBid detectables ja després de 4 hores de tractament (figura 4a, esquerra). A més, la activació de la caspasa-8 i Bid activada per TRAIL van anar acompanyades de l’alliberament del citocrom c i SMAC coincidint amb l’activació de la caspasa-3 i la divisió de PARP (figura 4a, esquerra). L’anàlisi de Western blot va revelar una degradació de XIAP depenent del temps en resposta a TRAIL, que pot reflectir l’autobiquitinació i la posterior degradació proteasomal o una ruptura mediada per la caspasa. 18

Image

La transició de permeabilitat mitocondrial precedeix la inducció de la mort cel·lular en les cèl·lules HCT 116, però no està involucrada en l’apoptosi induïda per TRAIL després de la desregulació de XIAP a les cèl·lules HCT 116 deficients de Bax / Bak. ( a ) 24 hores després de la transfecció de HCT116 en pes amb siRNA de control (esquerra) i HCT116 Bax-/ Bak- amb XIAP-siRNA (dreta), les cèl·lules van ser tractades amb TRAIL i cultivades durant el temps indicat. L’anàlisi de Western blot va revelar el processament precoç de la caspasa-8 i -3 i la divisió de Bid i PARP a les dues línies cel·lulars. A les cèl·lules en pes de HCT116, es va observar alliberament del citocrom c i SMAC al citosol 4 hores després del tractament amb TRAIL. En canvi, l'alliberament del citocrom c i SMAC va ser un fet tardà a les cèl·lules HCT116 Bax- / Bak-. ( b ) Les cèl·lules es van tractar tal com es descriu a ( a ), es van obtenir i els percentatges de cèl·lules amb pèrdua de ΔΨm es van determinar mitjançant la mesura citomètrica de flux de fluorescència JC-1. A més, els percentatges de cèl·lules apoptòtiques es van determinar mitjançant la mesura citométrica de flux de cèl·lules hipodiploides. Aquestes anàlisis van revelar que a les cèl·lules en massa HCT116, la pèrdua de potencial de membrana mitocondrial precedeix la fragmentació de l’ADN apoptòtic. En contrast amb les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak-amb regulació descendent XIAP, on la pèrdua de potencial de membrana mitocondrial, l’alliberament de citocrom c i SMAC són esdeveniments tardans. Dades expressades com a valors mitjans ± SD de tres experiments

Imatge a mida completa

Per analitzar la dissipació del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) al tractament amb TRAIL, es van incubar les cèl·lules amb el fluorocrom JC-1, que presenta una acumulació de potencial de membrana mitocondria. La mesura de la intensitat de fluorescència de JC-1 per citometria de flux va mostrar una acumulació de temps de cèl·lules HCT116 en pes amb interrupció de ΔΨm després del tractament TRAIL. Es tracta d'un esdeveniment precoç detectable ja després de 6 h de tractament que precedia la fragmentació d'ADN (figura 4b, esquerra).

De manera analògica, les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak amb XIAP regulada a la baixa van mostrar el processament de la caspasa-8 i Bid com a esdeveniments inicials durant l'apoptosi induïda per TRAIL, detectables 4 hores després del tractament. En contraposició a les cèl·lules en massa HCT116, la divisió de Bid no va coincidir, però, amb el citocrom c o l'alliberament de SMAC. Totes dues es van produir tard després del tractament amb TRAIL, detectable després de les 12 h (figura 4a, dreta). Això indica que tBid no ha pogut activar la via mitocondrial. No obstant això, el tractament TRAIL en absència de XIAP va donar lloc a l'activació precoç de la caspasa-3, que va coincidir amb la ruptura de PARP (figura 4a, dreta). A més, malgrat la inducció precoç de l’apoptosi, però en consonància amb la retardada cinètica del citocrom c i l’alliberament de SMAC, la MMP també va ser un esdeveniment tardà en aquestes cèl·lules. Curiosament, i en contrast amb les cèl·lules en pes de HCT116, el desglossament de ΔΨm va seguir la fragmentació de l'ADN després del tractament TRAIL a les cèl·lules HCT116 Bax- / Bak− (Figura 4b, dreta), cosa que indica que la MMP es produeix tard i coincideix amb la desaparició cel·lular en lloc de jugar paper regulador precoç. En resum, la baixada de la XIAP facilita la senyalització d’apoptosi induïda per TRAIL que és independent de l’alliberament de MMP, el citocrom c i l’alliberament de SMAC, que semblen tenir efectes secundaris.

L'anàlisi de resposta en temps de la tinció amb annexina V-FITC / PI al tractament amb TRAIL confirma el diferent mode de mort cel·lular. Les cèl·lules apoptòtiques primerenques es van detectar ja 4 hores després del tractament TRAIL en cèl·lules en pes de HCT116 i en les cèl·lules Bax / Bak-HCT116 amb XIAP regulat. No obstant això, les cèl·lules en pes HCT116 tendeixen a l’aparició precoç d’un fenotip apoptòtic tardà, detectable després de 8 h de tractament amb TRAIL. En canvi, les cèl·lules Bax-Bak / HCT116 apoptòtiques tardanes es van detectar al cap de les 12 h més aviat (figura suplementària S3). Curiosament en aquest moment, les cèl·lules HCT116 Bax-Bak també mostren l'alliberament de MMP i citocrom (fig. 4a i b). Agrupats, els resultats indiquen que l'alliberament de MMP i citocrom c , que es produeixen precoçment en les cèl·lules de tipus II i tardanes en el tipus I, van acompanyats d'un fenotip apoptòtic / necrotic tardà de les cèl·lules.

Tenint en compte l'impacte terapèutic de les nostres troballes, es va preguntar a continuació si molècules petites, que se sap que regulen o inhibeixen XIAP, poden superar la resistència de les cèl·lules deficients de Bax / Bak. L’agent antitumoral Mitramicina A (Mit A) sensibilitza diverses línies de cèl·lules cancerígenes a l’apoptosi mediada per TRAIL mitjançant la desregulació de XIAP. 19 Per confirmar la baixada de XIAP per Mit A, vam tractar les cèl·lules HCT116 en pes i HCT116 Bax-/ Bak-amb diferents concentracions de Mit A durant 24 hores. L'anàlisi posterior dels nivells de XIAP va confirmar l'expressió XIAP reduïda (figura 5a). Això va acompanyat d’una augmentada sensibilitat TRAIL a les cèl·lules HCT116 en pes, principalment a causa de la toxicitat additiva de Bax / Bak, dependent de Mit A. A més, el tractament Mit A va vèncer eficientment la resistència TRAIL de les cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bak (Figura 5a, panell inferior).

Image

La desregulació o la inhibició de XIAP per mitramicina A o LBW-242, respectivament, supera la resistència TRAIL. ( a ) Les cèl·lules HCT116 en pes i Bax- / Bak-es van incubar prèviament amb concentracions indicades de Mit A i es va observar la regulació inferior de XIAP en immunoblot (plafó superior). Les cèl·lules van ser tractades amb TRAIL i cultivades durant 24 hores addicionals. La mesura de les cèl·lules apoptòtiques per citometria de flux va revelar que les cèl·lules deficients de Bax / Bak sensibilitzaven per Mit per a l’apoptosi induïda per TRAIL. Dades expressades com a valors mitjans ± SD de tres experiments (panell inferior). ( b ) Per inhibir la funció XIAP, ambdues línies cel·lulars es van tractar amb 10 μ M de la mimètica SMB LBW-242 a més de TRAIL. A les cèl·lules en pes de HCT116, el processament de caspasa-3 induït per TRAIL es va augmentar amb LBW-242 (esquerra superior). L’augment del processament de caspasa-3 es va paral·lelitzar amb la inducció millorada de l’apoptosi (a l’esquerra inferior). A les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak-, es va escindir la pro-caspasa-3 després del tractament amb TRAIL. Els fragments proteolítics, però, només es van detectar amb l'addició de LBW-242 (a la part superior dreta). L’activació de la caspasa-3 va provocar la inducció d’apoptosi, cosa que indica que la LBW-242 pot superar la resistència TRAIL de les cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bak (a la dreta dreta). La importància estadística es va determinar mitjançant la prova t de l'estudiant no comparada. Els nivells de significació estadística s'indiquen amb asteriscs (* P <0.05; ** P <0.01)

Imatge a mida completa

A més, vam orientar directament XIAP mitjançant l’ús del SMAC mimètic LBW-242, una molècula petita sintètica que s’uneix i inhibeix els IAP. El tractament de les cèl·lules HCT116 amb LBW-242 a més de TRAIL va reduir l'expressió XIAP (figura 5b, panell superior, carrils 2 i 4), que podria ser degut a la clivada de XIAP per caspasa-3 en un bucle de retroalimentació o una autobiquitylation i degradació proteasomal. A més, la inhibició de XIAP va suposar un augment de l’apoptosi induïda per TRAIL a les cèl·lules HCT116 en pes i, el que és més important, va superar la resistència TRAIL de les cèl·lules amb doble deficiència de Bax / Bak (figura 5b, panell inferior). La re-sensibilització de les cèl·lules HCT116 Bax-/ Bak-és causada pel processament complet de la pro-caspasa-3 ja que les subunitats actives van ser detectables només després del tractament combinat amb TRAIL i LBW-242 (Figura 5b, panell superior). Així, com BZM, MG132 o Mit A, LBW-242 supera la resistència TRAIL i facilita l’activació induïda per TRAIL de la caspasa-3 i la inducció d’apoptosi de manera I.

Per analitzar si XIAP juga un paper similar en la mort cel·lular induïda per altres receptors de mort, es va tractar cèl·lules amb TNF α o CD95L / FasL. A les cèl·lules en pes de HCT116, el tractament amb TNF α va provocar una inducció feble de l’apoptosi; ∼ El 10% de les cèl·lules eren apoptòtiques (figura 6a). En comparació amb el TNF α , la fragmentació de l’ADN induïda per CD95L / FasL va ser més acusada i el 24% de les cèl·lules van patir apoptosi. No obstant això, després de la regulació XIAP, la TNF α , així com l’apoptosi induïda per CD95L / FasL, es van incrementar fins a un 16% i un 37%, respectivament. A diferència de les cèl·lules en pes HCT116, ni TNF α ni CD95L / FasL van induir l'apoptosi a les cèl·lules Bax-/ Bak-HCT116. Tanmateix, la resistència va ser superada per la desregulació de XIAP, donant lloc a al voltant del 17% i el 25% de cèl·lules apoptòtiques després del tractament amb TNF α o CD95L / FasL, respectivament (Figura 6b). En conjunt, aquestes dades mostren que la regulació baixa de XIAP permet als receptors de la mort matar cèl·lules de tipus II independentment de la maquinària de mort mitocondrial, canviant la via de senyalització apoptòtica del tipus II al tipus I.

Image

XIAP media la resistència a l’apoptosi induïda per TNF α i CD95 / FasL en cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bak. ( a ) Les cèl·lules HCT116 en pes es van transfectar amb control o XIAP-siRNA i es van cultivar durant 24 hores. Després del cop de XIAP, es van tractar cèl·lules amb TNF α o CD95L / FasL i es van cultivar durant 24 hores addicionals. La mesura de la fragmentació de l’ADN apoptòtic va revelar que les cèl·lules HCT116 en pes eren sensibilitzades cap a l’apoptosi induïda per TNF α o CD95L / FasL després de la regulació baixa de XIAP. ( b ) Les cèl·lules Bax- / Bak-HCT116 es van tractar com a ( a ). La mesura de les cèl·lules apoptòtiques va revelar que les cèl·lules Bax-Bak / HCT11 transfectades amb siRNA de control eren resistents a la mort cel·lular induïda per TNF α o CD95L / FasL. Tanmateix, la regulació a la baixa de XIAP va permetre que TNFα i CD95L / FasL (TRAIL) indueixin l’apoptosi malgrat la deficiència de Bax / Bak. Es mostren dades expressades com a valors mitjans ± SD de tres experiments. Els nivells de significació estadística s'indiquen amb asteriscs (* P <0.05; ** P <0.01)

Imatge a mida completa

Discussió

Les estratègies per superar la resistència TRAIL inclouen la inhibició de la senyalització pro-supervivència, per exemple, la via NF- B, 20 la inhibició del proteasoma 21 o la inhibició de la histona desacetilases. 22 La inhibició de la cinasa inhibeix la Roscovitina o Sorafenib sensibilitzen les cèl·lules canceroses a TRAIL mitjançant mecanismes pleiotròpics que consisteixen en la formació de DISC facilitada i l’activació de la caspasa-8, la baixada de la cFLIP i la XIAP i la supressió de Mcl-1. 14, 23, 24 Les estratègies dirigides directament a la família Bcl-2 inclouen mimetics BH3 com ABT-737 que s’uneixen al solc hidrofòbic exposat a la superfície de proteïnes antiapoptòtiques, bloquegen la seva funció de supervivència i potencien l’apoptosi mediada per TRAIL. 25 Tot i això, la mort cel·lular encara es basa en la presència de Bax i Bak com a mediadors de MMP. La inhibició dels PAI és un altre enfocament prometedor per sensibilitzar les cèl·lules tumorals resistents al tractament de TRAIL. Especialment, s'ha demostrat que la inhibició de XIAP per part dels petits mimetics moleculars de SMAC sinergitza amb TRAIL i potenciar l'apoptosi induïda per TRAIL en diverses cèl·lules canceroses. 26, 27

No només es va abordar el paper, sinó també l’orientació farmacològica d’XIAP en la senyalització tipus I / II. En contrast amb les cèl·lules de tipus I, les cèl·lules de tipus II requereixen l’activació d’un bucle d’amplificació mitocondrial per aconseguir l’activació completa de la caspasa que depèn de l’activació de Bid. Curiosament, un informe recent va demostrar que la pèrdua de XIAP alleuja la necessitat d’oferta en l’apoptosi d’hepatòcits induïda per Fas en CD95 / ratolins. 28

Aquí, es demostra que la resistència TRAIL de cèl·lules del carcinoma de tipus II amb defectes de senyalització de la mort mitocondrial central es va superar per inhibició de XIAP. Això va permetre a TRAIL induir apoptosi en cèl·lules que sobreexpressen les proteïnes anti-apoptòtiques Bcl-2 o Bcl-x L o en cèl·lules deficients per a les proteïnes pro-apoptòtiques Bax, Bak i Bid. En aquestes condicions, l’apoptosi no s’acompanya de l’alliberament de MMP i del citocrom c o SMAC, cosa que indica que la inducció de la mort cel·lular és independent de la via intrínseca. Això contrasta amb les cèl·lules positives de Bax / Bak, on l'alliberament de MMP i el citocrom c precedeix l'apoptosi. Així, la regulació inferior de XIAP anul·la un bloqueig de mort cel·lular al nivell del mitocondri mitjançant la commutació de la senyalització per apoptosi del tipus II al tipus I. Aquesta observació amplia significativament altres estudis que van identificar el nivell d’activació de la caspasa-8 a l’activació del receptor de la mort com a discriminador crític entre senyalització per apoptosi tipus I / II 5 Segons aquest model, les cèl·lules del tipus I mostren una forta activació de la caspasa-8 després de la lligada del receptor de la mort per activar directament la caspasa-3, deixant així la mitocondria. En canvi, les cèl·lules del tipus II generarien només quantitats baixes de caspasa-8 activa al DISC i una forta activació de la caspasa-3 es produeix a un nivell secundari als esdeveniments mitocondrials. Tot i això, en les cèl·lules HCT116 l’activació de la caspasa-8 induïda per TRAIL és suficient per escindir pro-caspasa-3 independentment de la pèrdua de l’expressió de Bax / Bak. No obstant això, la pro-caspasa-3 només es processa a les seves subunitats actives només en cèl·lules amb una via de senyalització apoptòtica mitocondrial intacta. En absència de MMP, les subunitats caspasa-3 van ser degradades per la via XIAP / proteasoma. En activar la mitocondria a través de Bax / Bak, SMAC, alliberada al citosol, inhibeix XIAP i evita la degradació de les subunitats de la caspasa-3 i es tradueix en una forta activació de la caspasa-3 (figura 7). Conseqüentment, la inhibició de XIAP permet a la caspasa-8 induir directament quantitats suficients de caspasa-3 activa en cèl·lules HCT116 deficients de Bax / Bak, fent que l'alliberament de SMAC sigui prescindible. En conjunt, demostrem que no és l'extensió de la caspasa-8 activa sinó l'activitat de XIAP, el que fa una distinció entre la inducció de la mort cel·lular a través d'una via de tipus II o de tipus I.

Image

Model de XIAP com a canvi entre la senyalització tipus I i tipus II. Vegeu el text per a més detalls. Mit A, Mitramicina A; BZM, bortezomib

Imatge a mida completa

L’orientació farmacològica d’aquest commutador tipus I / II superaria la necessitat de coneixements de Bax / Bak. En aquesta línia, demostrem que el processament de la pro-caspasa-3 a les seves subunitats actives sense activació del mitocondri es pot aplicar per inhibició del proteasoma. Proteasome inhibitors may sensitize tumor cells for TRAIL by enhanced cell surface expression of TRAIL-R1 (DR4) and TRAIL-R2 (DR5), enhanced activation of the initiator caspase-8 and downregulation of cFLIP. 29, 30 Furthermore, bortezomib-induced stabilization of the Bax protein as well as increased levels of Nbk/Bik and Bim were implicated in sensitization for TRAIL killing. 31, 32 Our data suggest that the stabilization of active caspase-3 by blocking its proteasomal degradation, by either inhibiting proteasomal activity or preventing XIAP-mediated ubiquitylation, is the main mechanism responsible for sensitization. Interestingly, the caspase-3 fragments, which accumulate upon proteasome inhibition in addition to TRAIL-treatment, seem to be unubiquitinated (Figure 2a). Caspases have been shown to inhibit XIAP by cleavage 33 and this feedback loop might be responsible for the accumulation of unubiquitinated active caspase-3 upon inhibition of the proteasome. However, inhibition of the proteasome or XIAP result in sufficient generation of active caspase-3 and mediate a switch from a type II to a type I mode of cell death. This notion is supported by experiments where we inhibited XIAP function by the use of the synthetic small molecule IAP inhibitor LBW-242 that mimics the activity of SMAC. LBW-242 is a promising compound to overcome drug resistance. 34, 35 Here, we show that LBW-242 overcomes resistance of Bax/Bak-deficient cancer cells and re-sensitizes these cells to TRAIL. Loss of both Bax or Bak expression has been reported for a number of tumors. 36, 37, 38, 39 Whereas loss of Bax is a frequent event in human cancer, for example, in colon cancers having a microsatellite mutator phenotype, Bak expression persists in most cancers and loss of both is a rare event. Notably, loss of Bax, despite expression of Bak, is sufficient for tumor cells to acquire TRAIL-resistance. In addition, the intrinsic apoptotic pathway of tumor cells can be blocked by other mechanisms, for example, upregulation of Bcl-x L (which efficiently inhibits both, Bax and Bak) or endogenous Bak-inhibitors Mcl-1 or VDAC2 in Bax-deficient carcinoma. 14, 15, 40 The data presented in this study indicate that use of SMAC mimetics is a suitable strategy to antagonize therapy resistance caused by all these central defects in the intrinsic apoptosis machinery and delineates the combined use of TRAIL together with SMAC mimetics as a useful strategy. Altogether, these data show that targeting of XIAP enables death receptor signaling to kill type II cells via a type I pathway and define XIAP as a crucial decision point between these two cell death pathways.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària S1

  2. 2

    Figura suplementària S2

  3. 3.

    Figura suplementària S3

Documents de paraula

  1. 1.

    Figura Legendes complementàries

Glossari

Bak

Bcl-2 homologous antagonist/killer

Bax

Bcl-2-associated x protein

Bcl-2

B-cell lymphoma 2

Bcl-x L

long splice variant of Bcl-x

BH3

Bcl-2 homology region 3

Bid

BH3-interacting domain death agonist

BZM

bortezomib

CD95/FasL

cluster of differentiation 95/fibroblast-associated ligand

IAP

inhibitor of apoptosis proteins

Mcl-1

myeloid cell leukemia 1

Mit A

Mithramycin A

MMP

mitochondrial membrane permeabilization

PI

propidium iodide

SMAC/DIABLO

second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pI

TNF

factor de necrosi tumoral

TRAIL

tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand

XIAP

X-linked inhibitor of apoptosis

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)