Lliurament tòpic de proteïnes i pèptids mitjançant un nou pèptid penetrant de cèl·lules imt-p8 | informes científics

Lliurament tòpic de proteïnes i pèptids mitjançant un nou pèptid penetrant de cèl·lules imt-p8 | informes científics

Anonim

Temes

  • Lliurament de mòbil
  • Lliurament de medicaments

Resum

La pell, sent l’òrgan més gran del cos, és un lloc important per a l’administració de medicaments. Tot i això, la majoria dels fàrmacs tenen una baixa permeabilitat i, per tant, el lliurament de fàrmacs a través de la pell és molt difícil. En aquest estudi, es va examinar la capacitat de lliurament transdèrmica d’IMT-P8, un nou pèptid que penetra en cèl·lules. Es van generar construccions de fusió IMT-P8-GFP i IMT-P8-KLA i es va avaluar la seva interiorització a la pell del ratolí després d'una aplicació tòpica. Els nostres resultats demostren que l’IMT-P8 és capaç de transportar proteïnes fluorescents verdes (GFP) i pèptid proapoptòtic, KLA a la pell i també en diferents línies cel·lulars. Curiosament, l’absorció d’IMT-P8-GFP va ser considerablement superior al TAT-GFP a les cèl·lules HeLa. Després de la interiorització, l'IMT-P8-KLA es va localitzar al mitocondri i va causar una mort cel·lular important a les cèl·lules HeLa que significa una activitat biològica intacta. Experiments de penetració de la pell in vivo van revelar que després de l’aplicació tòpica, l’IMT-P8 va penetrar l’estratèrmum, va entrar a l’epidermis viable i es va acumular dins dels fol·licles pilosos. A més, tant IMT-P8-KLA com IMT-P8-GFP es van interioritzar als fol·licles pilosos i al teixit dèrmic de la pell després d'una aplicació tòpica. Aquests resultats suggereixen que l’IMT-P8 podria ser un candidat potencial per ser utilitzat com a vehicle d’entrega d’actualitat per a diverses aplicacions de malalties cosmètiques i de pell.

Introducció

El lliurament de molècules terapèutiques a través de la pell ha anat guanyant una atenció científica tremenda al llarg dels anys. Tot i que el tractament terapèutic a través de la pell és no invasiu, senzill i proporciona molts beneficis als pacients, és molt difícil, ja que la pell proporciona una barrera protectora contra influències externes 1 . La capa més externa de la pell, estratum corneum (SC) està formada per cèl·lules no viables plenes de queratina incrustades en un domini 2 de lípids intercel·lulars cristal·lins i impermeables a gairebé tots els compostos i fàrmacs amb un pes molecular superior a 500 Da 3 . Per tant, en el passat s'han intentat examinar els mètodes innovadors i innovadors per augmentar la permeabilitat de la pell 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 . El lliurament de pell es centra principalment en el lliurament tòpic per tractar les afeccions locals de la pell o el lliurament de fàrmacs transdèrmics, que implica el lliurament de medicaments a través de capes de la pell a la circulació sistèmica 4 . El lliurament tòpic ofereix diversos avantatges respecte a les formes de dosificació convencionals (orals i intravenoses) com evitar el metabolisme de primera passada, la facilitat d’aplicació, redueix la degradació enzimàtica associada amb el part oral, la millora del compliment del pacient i l’alliberament controlat de fàrmacs 4, 11 .

Recentment, els pèptids han aparegut com a alternatives més segures per millorar el lliurament de molècules petites i grans a la pell i a través de la pell 12 . En aquest context, el lliurament transdèrmic de terapèutiques mitjançant pèptids penetrants cel·lulars (CPPs) és un enfocament nou i atractiu 11 . Els CPP constitueixen una família de petits pèptids, que tenen una capacitat inherent de travessar la membrana biològica sense causar danys importants a la membrana 13, 14, 15 . Per tant, en el passat, les PCC s’han utilitzat àmpliament per al lliurament intracel·lular de moltes molècules terapèutiques com ara siRNA 16, 17, proteïna 18 i pèptids 19 in vitro i in vivo . Tanmateix, l’ús de pèptids com a sistema de lliurament transdèrmic és nou 12 i encara està a la seva infància. En el passat recent, uns quants estudis han demostrat que petits pèptids com TAT 20, la polarginina 21, la meganina 22, la penetratina 23, la TD-1 24 i el peptid SPACE 25 poden penetrar en les barreres protectores de la pell per arribar a les capes més profundes i millorar. el lliurament transdèrmic de diverses molècules terapèutiques com siRNA 26, ciclosporina A 27, insulina, etc. Els resultats d’aquests estudis són prometedors i augmenten l’esperança que els CPP s’utilitzin com a sistema de lliurament transdèrmic per combatre malalties de la pell.

Recentment, hem identificat i caracteritzat un nou CPP ric en arginina derivat de proteïnes humanes, IMT-P8 (IMT-P8; Institute of Microbial Technology-Peptide 8) 28 utilitzant l'algoritme de predicció silico , CellPPD 29 i seguit de validació experimental. L’objectiu del present estudi era investigar la capacitat d’entrega de càrrega de l’IMT-P8 en diferents sistemes de models, inclòs el lliurament tòpic. Com que l’IMT-P8 és un CPP nou i el seu potencial de lliurament de càrrega no s’havia explorat anteriorment, primer hem examinat el tipus de càrrega que pot aportar IMT-P8. Abans de realitzar experiments amb pell de ratolí per a un lliurament tòpic, primer es va examinar el lliurament de càrrega amb IMT-P8 en cèl·lules humanes en creixement continu. Aquests experiments in vitro van confirmar que l’IMT-P8 és capaç d’entregar càrregues (FITC, pèptid i proteïnes) a diverses cèl·lules humanes. A continuació, es va intentar determinar si l’IMT-P8, que té la capacitat de travessar la barrera de la membrana plasmàtica de les cèl·lules humanes, també podria travessar l’estrat corneu de la capa de cèl·lula morta més externa i lliurar càrrega a les capes de la pell. Moltes CPP, és a dir, la TAT 30, la penetratina 31 i l'oligoariginina 32 s'han informat prèviament per lliurar càrregues (àcid nucleic, proteïnes, pèptids, etc. ) en diferents línies cel·lulars. Més endavant, diversos estudis van demostrar l'eficiència penetrant en la pell d'aquestes PCC i complexos de càrrega a la pell d'animals de laboratori 21, 33, 34, 35 . Per tant, en el present estudi, també hem avaluat el potencial d’entrega de càrrega d’IMT-P8 en diferents sistemes de models.

Es va construir una proteïna de fusió IMT-P8-GFP i un pèptid de fusió IMT-P8-KLA per investigar el lliurament de GFP i pèptid proapoptòtic, KLA a la pell del ratolí, així com en diverses línies cel·lulars canceroses. Els nostres resultats demostren que l’IMT-P8 facilita l’entrega de GFP i KLA a la pell del ratolí i a diferents cèl·lules tumorals humanes a una concentració molt baixa, cosa que suggereix que l’IMT-P8 pot ser beneficiós per al tractament d’infeccions cutànies locals i diverses aplicacions cosmètiques.

Resultats

Lliurament in vitro de KLA per IMT-P8

Per examinar el tipus de càrrega IMT-P8 podria lliurar, primer, es va conjugar KLA, un pèptid pro-apoptòtic amb IMT-P8. La internalització de IMT-P8-KLA marcada amb FITC en diverses cèl·lules tumorals humanes (cèl·lules HeLa, MDA-MB-231 i PC3) es va controlar incubant les cèl·lules amb IMT-P8-KLA i KLA solament (2, 5 μM) durant 30 min a 37 ° C seguit d’anàlisi de citometria de flux. Ja que la citometria de flux no diferencia la fluorescència obtinguda del pèptid interioritzat i dels pèptids units a la superfície; per tant, després del tractament amb pèptids marcats amb FITC, les cèl·lules es van esbandir amb heparina (100 μg / ml) i es van incubar amb trypsina (1 mg / ml) durant 10 min a 37 ° C per eliminar els pèptids associats a la membrana extracel·lular 36 . Els resultats de l’anàlisi de citometria de flux es mostren a la Fig. 1. Es va observar una fluorescència FITC intracel·lular significativa en cèl·lules HeLa (Fig. 1A, B), MDA-MB-231 (Fig. 1C, D) i cèl·lules PC3 (Fig. 1E, F) incubat amb IMT-P8-KLA. En canvi, es va observar fluorescència negligible en el cas de cèl·lules tractades amb pèptid FITC-KLA (Fig. 1). Aquests resultats van suggerir que l'IMT-P8 va lliurar de forma eficaç el pèptid KLA, que no es pot interioritzar per si sol, en les cèl·lules canceroses.

Image

Distribucions de freqüència de la intensitat de fluorescència FITC en ( A ) HeLa, ( C ) MDA-MB-231 i ( E ) cèl·lules PC3 incubades amb FITC marcades KLA i IMT-P8-KLA. (Només cèl·lules: negre; KLA: blau i IMT-P8: vermell). Durant la nit, les cèl·lules HeLa i MDA-MB-231 van ser incubades amb pèptids marcats amb 2, 5 μM FITC durant 30 min i les cèl·lules PC3 van ser incubades amb pèptids de 5 μM durant 1 h en un medi lliure de sèrum. Després de la incubació, es van rentar les cèl·lules amb PBS, es van esbandir amb heparina (100 μg / ml), i després es van tractar amb trypsina (1 mg / ml) a 37 ° C durant 10 min. Finalment, les cèl·lules es van suspendre en PBS i van ser sotmeses a citometria de flux. Diagrames de barres que mostren l’absorció de KLA i IMT-P8-KLA com a fluorescència cel·lular mitjana a les cèl·lules ( B ) HeLa, ( D ) MDA-MB-231 i ( F ) PC3 a partir de l’anàlisi citomètrica de flux de totes les cèl·lules vives positives per a FITC. En B, D i F, les dades s’expressen com a mitjana ± SE basades en triplicats d’almenys dos experiments independents. Els asterisques indiquen una importància segons la prova t de l'alumne (de dues cues); (* p <0, 05).

Imatge a mida completa

Com que KLA és un pèptid amfipàtic catiònic i es va informar prèviament que s’acumula en els mitocondris 37, es va examinar a continuació la localització intracel·lular d’IMT-P8-KLA. Per a això, les cèl·lules HeLa tractades amb IMT-P8-KLA (2, 5 μM) es van analitzar mitjançant microscòpia confocal-laser scaning (CLSM). Tal com es mostra a la figura 2A, IMT-P8-KLA es va interioritzar a les cèl·lules HeLa com a fluorescència citosòlica completa que es va observar a les cèl·lules HeLa, mentre que no es va observar fluorescència a les cèl·lules tractades només amb KLA. Aquests resultats van ser consistents amb l’anàlisi de classificació de cèl·lules (FACS) activada per fluorescència. L’anàlisi CLSM de cèl·lules tractades amb FITC-IMT-P8-KLA va revelar la seva co-localització amb MitoTracker, un colorant específic per a mitocondris (Fig. 2B) que suggereix l’acumulació d’IMT-P8-KLA al mitocondri. En canvi, sota la mateixa condició, el FITC-IMT-P8 no va mostrar cap co-localització amb el colorant Mitotracker (Fig. 2B) que suggereix la capacitat específica d’orientació mitocondrial de l’IMT-P8-KLA. Com que el KLA és un pèptid pro-apoptòtic ben conegut que indueix l’apoptosi de les cèl·lules pertorbant la membrana mitocondrial, a continuació es va intentar examinar l’activitat funcional d’IMT-P8-KLA dins de les cèl·lules mitjançant 3- (4, 5-dimetilthiazol-2-yl) ) Assaig de bromur de -2, 5-difeniltetrazolium (MTT). Per això, es van incubar les cèl·lules HeLa amb una concentració creixent (0, 5, 10 i 20 μM) de IMT-P8-KLA i KLA no marcades soles durant 24 hores seguides de la determinació de la mort cel·lular mitjançant assaig MTT. Es va observar una disminució de la viabilitat cel·lular depenent de la dosi en totes les línies cel·lulars examinades (Fig. 3). Es va observar una disminució significativa de la viabilitat cel·lular a 20 μM. Tots aquests resultats van confirmar que l’IMT-P8 va lliurar el pèptid KLA a les cèl·lules i després de la interiorització, l’IMT-P8-KLA es va localitzar a mitocondris on provoca la mort de les cèl·lules pertorbat la membrana mitocondrial.

Image

( A ) Imatges confocals que mostren co-localització entre IMT-P8-KLA i Mito Tracker Red amb l'etiqueta FITC. Durant la nit, les cèl·lules HeLa cultivades durant la nit es van incubar amb FITC-IMT-P8 (2, 5 μM) i Mito Tracker Red (100 nM) durant 30 min a 37 ° C. Es van rentar les cèl·lules tres vegades amb PBS i es van imaginar cèl·lules vives. Les barres d’escala són de 10 μm . La intensitat del làser i la configuració del fotomultiplicador s’han ajustat per obtenir la millor visualització de cada imatge i, per tant, les intensitats no són directament comparables. ( B ) Imatges que mostren els espectres d'intensitat de la intensitat del colorant FITC (verd) i Mito tracker (vermell) al llarg de la línia blava de la imatge fusionada a ( A ).

Imatge a mida completa

Image

( A ) Les cèl·lules HeLa, ( B ) PC3 i ( C ) MDA-MB-231 van ser incubades amb concentracions creixents (5, 10 i 20 μM) de pèptids en sèrum que contenen medi a 37 ° C durant 24 hores. Es va mesurar la viabilitat cel·lular mitjançant el test MTT. La viabilitat de les cèl·lules només (sense pèptid) es va prendre com a 100% i es va representar la viabilitat de les cèl·lules tractades amb una concentració creixent de pèptids com a percentatge de control. Els resultats s’expressen com a mitjana ± SE basats en triplicats d’almenys dos experiments independents. Els asterisques indiquen una importància segons la prova t de l'alumne (de dues cues); (* p <0, 05).

Imatge a mida completa

Purificació de TAT-GFP recombinant i IMT-P8-GFP

Els vectors que expressen GFP, TAT-GFP i IMT-P8-GFP es van construir tal com s’explica als mètodes. Per a la producció i purificació de proteïnes, les cèl·lules BL21DE3star de E. coli (pLysS) (Invitrogen) es van transformar amb les construccions esmentades anteriorment i les proteïnes recombinants es van expressar com a proteïnes solubles. Les proteïnes recombinants GFP (~ 27 kDa), TAT-GFP (~ 29 kDa) i IMT-P8-GFP (~ 29 kDa) van ser confirmades per la tinció de blau brillant de Coomassie (Fig. 4A).

Image

( A ) Identificació de proteïna recombinant (GFP, TAT-GFP i IMT-P8-GFP) mitjançant una tinció de color blau brillant de la coomassie. ( B ) Distribucions de freqüència de la intensitat de fluorescència GFP a les cèl·lules HeLa incubades només amb GFP, TAT-GFP i IMT-P8-GFP (Cèl·lules només: negre; GFP: verd; TAT-GFP: vermell; i IMT-P8-GFP: blau ). Durant les nits, es van incubar cèl·lules HeLa amb 5 μM de proteïnes recombinants durant 1 h en medi lliure de sèrum. Després de la incubació, es van rentar les cèl·lules amb PBS, es van esbandir amb heparina (100 μg / ml), i després es van tractar amb trypsina (1 mg / ml) a 37 ° C durant 10 min. Finalment, les cèl·lules es van suspendre en PBS i van ser sotmeses a citometria de flux. ( C ) Diagrama de barres que mostra la absorció de proteïnes recombinants com a fluorescència cel·lular mitjana a partir de l'anàlisi citomètrica de flux de totes les cèl·lules vives positives per a la GFP. ( D ) Diagrama de barres que mostra el percentatge de cèl·lules positives de GFP. A C, D, els resultats s’expressen com a mitjana ± SE basats en triplicats d’almenys dos experiments independents. Els asterisques indiquen una importància segons la prova t de l'alumne (de dues cues); (* p <0, 05). ( E ) Localització intracel·lular de IMT-P8-GFP a les cèl·lules HeLa, determinada per microscopi làser d’escaneig confocal.

Imatge a mida completa

Lliurament in vitro de GFP per IMT-P8

A continuació, per avaluar si IMT-P8 podia portar macromolècules grans com la proteïna GFP a les cèl·lules, es va controlar la internalització d’IMT-P8-GFP incubant cèl·lules HeLa amb IMT-P8-GFP (5 μM) seguit d’anàlisi de citometria de flux. Es va comparar l'absorció d'IMT-P8-GFP amb TAT-GFP i GFP. Abans de l'anàlisi, les cèl·lules tractades es van esbandir amb heparina (100 μg / ml) i es van incubar amb trypsina (1 mg / ml) durant 10 min per eliminar qualsevol proteïna associada a la membrana 36 . Com es mostra a la Fig. 4B, C, es va observar una intensitat de fluorescència GFP considerablement més alta a les cèl·lules HeLa tractades amb IMT-P8-GFP en comparació amb les cèl·lules tractades amb TAT-GFP. Es va observar fluorescència insignificant només a les cèl·lules tractades amb GFP. També es van observar observacions similars quan es van incubar cèl·lules PC3 i RWPE-1 amb IMT-P8-GFP i TAT-GFP (dades no mostrades). Aproximadament, es va trobar que el 60% de cèl·lules HeLa eren positives amb GFP quan es van tractar amb IMT-P8-GFP en comparació amb cèl·lules tractades amb TAT-GFP, en les quals només el 25% de cèl·lules eren positives amb GFP (Fig. 4D), cosa que suggereix que la presa de IMT- P8-GFP era eficient i superior al TAT-GFP.

Per confirmar encara més la internalització i determinar la localització intracel·lular de l’IMT-P8-GFP, es van incubar les cèl·lules HeLa amb IMT-P8-GFP (5 μM) durant 1 h a 37 ° C i es van examinar mitjançant microscòpia confocal. Com es mostra a la Fig. 4E, IMT-P8-GFP va ser interioritzada a les cèl·lules HeLa, que eren consistents amb l’anàlisi FACS. Es va observar un patró puntual de fluorescència IMT-P8-GFP que indica la presència de IMT-P8-GFP als compartiments vesiculars després de la interiorització (Fig. 4E). Aquests resultats eren similars a la nostra observació anterior amb el pèptid IMT-P8 que també mostrava un patró de fluorescència puntual i que recorda un mecanisme endocític de captació 28 . Si es van agafar tots aquests resultats, es pot suggerir que IMT-P8 va aportar GFP de manera més eficient que el pèptid TAT a les cèl·lules HeLa i IMT-P8-GFP es va interioritzar mitjançant endocitosi.

Propietats penetrants a la pell de IMT-P8 in vivo

Tenint en compte els resultats que demostren que l’IMT-P8 és capaç de transportar KLA i GFP a les cèl·lules tumorals humanes, hem volgut investigar més si IMT-P8 té la capacitat de penetrar en la SC, la capa més externa de la pell i entrar a l’epidermis, de manera que es podria utilitzar com a portador per al lliurament tòpic i / o transdèrmic de pèptids i proteïnes. Per solucionar-ho, es va aplicar tòticament IMT-P8 (15 μl d'1 mM) marcat amb FITC a la pell del ratolí afaitat i es va examinar el grau de penetració de la pell de IMT-P8 2 i 24 hores després de l'aplicació tòpica mitjançant l'anàlisi de la pell gelada. seccions al microscopi confocal. Com que TAT s’ha utilitzat per a l’entrega tòpica de càrrega en estudis anteriors 38, FITC-TAT també es va aplicar tòpicament com a control positiu, mentre que només es va utilitzar PBS com a vehicle. Com es mostra a la figura 5, després de 2 h, les seccions de pell tractades amb FITC-IMT-P8 i FITC-TAT van revelar una fluorescència verda significativa a tota l’epidermis i una fluorescència difusa al teixit dèrmic, cosa que suggereix que l’IMT-P8 té la capacitat de penetrar SC i interioritzada a l’epidermis. Juntament amb l'epidermis, també es va observar una fluorescència verda clara en els fol·licles pilosos a les seccions de pell tractades amb pèptids (IMT-P8 i TAT) durant 24 hores, cosa que suggereix la penetració dels pèptids als fol·licles pilosos (figura suplementària Fig. S2). No obstant això, la intensitat de fluorescència verda va ser més alta en l'epidermis. No es va observar fluorescència significativa quan només es va aplicar tònicament PBS. La quantitació mitjançant la recopilació de dades de trames superficials bidimensionals va indicar que la intensitat de fluorescència del FITC era de 30, 43 ± 6, 46 i 18, 733 ± 5, 50 unitats arbitràries per a FITC-IMT-P8 i FITC-TAT respectivament (Taula suplementària S1). Aquests resultats demostren que, similar al TAT, l’IMT-P8 també té la capacitat de penetrar a la pell del ratolí.

Image

Imatges confocals que demostren la penetració d’IMT-P8 a la pell de ratolins. Breument, 15 μL de pèptids d'1 mM (TIT i IMT-P8) es van aplicar tòpicament sobre una zona d'afaita de la pell del ratolí. Les seccions verticals congelades dels teixits de la pell es van obtenir 2 h després de l'aplicació de pèptids i observades per un microscopi confocal de rastreig làser. Les dades són representatives de tres experiments independents amb resultats similars.

Imatge a mida completa

Lliurament in vivo de pell de GFP i KLA mitjançant IMT-P8

La capacitat de penetració d’IMT-P8 a la pell del ratolí després d’aplicar tòpics ens va impulsar a investigar encara més el potencial d’entrega de GFP i KLA a la pell mitjançant IMT-P8. Per a això, IMT-P8-GFP, TAT-GFP i GFP (30 μg cadascun) es van aplicar tòpicament sobre la pell rapada de ratolins adults. Els animals van ser sacrificats 24 hores després, i es van examinar seccions verticals congelades de la regió tractada mitjançant microscòpia confocal. Es va notar que només en el cas de GFP, es va observar fluorescència verda menyspreable fora de la SC, en epidermis i dermis (Fig. 6), mentre que es va observar una fluorescència verda considerable tant en l’epidermis, els fol·licles pilosos, com en les capes més profundes de la pell. quan es tracta amb IMT-P8-GFP i TAT-GFP (Fig. 6). La quantitació mitjançant la recopilació de dades de trames superficials bidimensionals va indicar que la intensitat de PFF era més alta a la secció de la pell tractada amb IMT-P8-GFP en comparació amb TAT-GFP (Taula complementària S1). A més, es va localitzar fluorescència IMT-P8-GFP a regions específiques de l'epidermis i la dermis. Aquests resultats van suggerir que IMT-P8-GFP i TAT-GFP van ser capaços de penetrar tant en l'epidermis com en la dermis, mentre que el GFP per si sol no va ser capaç de penetrar a la pell.

Image

Imatges confocals que mostren la interiorització d’IMT-P8-GFP a la pell dels ratolins. La pell de ratolins es va afaitar un dia abans de l’inici de l’experiment. Es van aplicar 30 μg de GFP, TAT-GFP i IMT-P8-GFP a la pell rapada del ratolí durant 24 hores. Les seccions congelades dels teixits de la pell es van obtenir 24 h després de l’aplicació de proteïnes recombinants i observades per un microscopi confocal de rastreig làser.

Imatge a mida completa

Es van observar troballes similars quan es van aplicar tópicament FITC amb IMT-P8-KLA i KLA (cada 15 μL d'1 mM) per sobre de la pell del ratolí. Després de la incubació de 2 h, es va observar una fluorescència FITC considerablement més alta a l’epidermis en el cas d’IMT-P8-KLA (Taula complementària S1), mentre que no es va observar fluorescència significativa a l’epidermis en el cas de KLA solament (Fig. 7). Es va observar una fluorescència significativa a l'interior dels fol·licles pilosos després de 24 hores, cosa que suggereix la penetració de IMT-P8 KLA als fol·licles pilosos (Fig. S3 complementària). Es va observar poca fluorescència dins dels fol·licles pilosos en el cas de KLA. La pell tractada només amb PBS no presentava fluorescència. Tots aquests resultats demostren que l’IMT-P8 no només penetra en la SC, sinó que també és capaç de transportar macromolècules com GFP i KLA a la pell.

Image

Imatges confocals que demostren el lliurament tòpic de KLA mitjançant IMT-P8. Es van aplicar tópicament 15 μL de pèptids d'1 mM (KLA marcats amb FLA i IMT-P8-KLA) sobre una zona d'afaita de la pell del ratolí. Les seccions congelades dels teixits de la pell es van obtenir 2 h després de l'aplicació de pèptids i observades per un microscopi confocal de rastreig làser.

Imatge a mida completa

Discussió

Durant l’última dècada, els petits pèptids han aparegut com a alternatives possibles per tractar diverses malalties, incloses la diabetis, l’oncologia i malalties metabòliques, cardiovasculars i infeccioses 39, 40, 41 . El creixement del desenvolupament de diverses bases de dades de pèptids terapèutics 13, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, així com els algoritmes in silico per a la predicció d’importants propietats del pèptid com la toxicitat 50, 51, la meitat. La vida 52, antigenicitat 53, 54, 55, 56, etc, ha accelerat la investigació basada en pèptids. Entre les diverses classes de pèptids terapèutics, els CPP han obtingut una atenció científica tremenda com un atractiu vehicle que subministra un medicament 41, 57 . El CPP, IMT-P8 és un pèptid nou penetrant en cèl·lules derivat de proteïnes humanes, ric en arginina, que va ser descobert i caracteritzat recentment 28 mitjançant un enfocament integrat en silici 29 i experimental. Tot i això, la capacitat de lliurament de càrrega de l’IMT-P8 no s’havia investigat anteriorment. Per tant, l'objectiu del present estudi era determinar la capacitat de lliurament de càrrega de l'IMT-P8. En aquest context, primer hem examinat la capacitat de lliurament de càrrega de l’IMT-P8 en diverses línies de cèl·lules tumorals humanes, incloses les cèl·lules HeLa i PC3.

Es va examinar si l’IMT-P8 pot lliurar petites càrregues com un petit pèptid. Per tant, vam seleccionar el pèptid KLA com a càrrega, que és un petit pèptid cationic amfipàtic mitocondrial que pertorba la membrana, que provoca inflor de la membrana mitocondrial que condueix a l’apoptosi quan s’entrega a les cèl·lules 58, 59 . Tanmateix, el KLA no pot pertorbar la membrana plasmàtica i, per tant, no és tòxic per a les cèl·lules eucariotes. Però quan es conjuga amb CPPs, el KLA es converteix en tòxic perquè pot travessar la membrana plasmàtica i alterar la membrana mitocondrial carregada negativament i alliberar el citocrom C 59 . Per tant, també hem examinat aquesta possibilitat de si l’IMT-P8 pot lliurar KLA dins de les cèl·lules eucariotes i provocar la mort cel·lular. L’anàlisi de citometria de flux de cèl·lules HeLa incubades amb pèptid de fusió FITC-IMT-P8-KLA va revelar la interiorització eficient d’IMT-P8-KLA a les cèl·lules HeLa, i aquests resultats es van confirmar encara més mitjançant l’anàlisi microscòpica confocal. Com era d'esperar, KLA sol no es va interioritzar a les cèl·lules. Curiosament, després de la interiorització, l’IMT-P8-KLA es va distribuir per tot el citoplasma i el nucli. També, una gran part de IMT-P8-KLA es va localitzar a mitocondris. Aquests resultats van ser coherents amb l'estudi anterior on es va demostrar que la CPP-KLA s'acumulava als mitocondris 60 . En canvi, la distribució intracel·lular de FITC-IMT-P8 era totalment diferent a la FITC-IMT-P8-KLA i no es va localitzar als mitocondris. Es va observar un patró citoplasmàtic puntual de fluorescència FITC quan es van tractar cèl·lules HeLa amb un pèptid FITC-IMT-P8 que suggeria que una part significativa d’IMT-P8 estava atrapada als compartiments vesiculars i aquesta observació estava d’acord amb les troballes anteriors que van interioritzar IMT-P8. per endocitosi 28 . Aquests resultats van suggerir que tant IMT-P8 com IMT-P8-KLA van ser interioritzats per endocitosi i després de la interiorització, IMT-P8 va quedar atrapat als endosomes mentre que IMT-P8-KLA podia escapar dels endosomes pertorbant la membrana endosòmica i posteriorment va entrar al nucli. i mitocondris. El KLA és un pèptid mitocondrial que pertorba la mort i provoca la mort cel·lular per interrupció de la membrana mitocondrial 37 . Per tant, per comprovar la funcionalitat d’IMT-P8-KLA dins de les cèl·lules, es va examinar la viabilitat cel·lular de cèl·lules HeLa tractades amb IMT-P8-KLA després de la incubació de 24 h. L’IMT-P8-KLA va causar mort cel·lular important mentre que tant l’IMT-P8 com el KLA sols no van ser efectius en cap concentració provada. Tots aquests resultats van suggerir que l’IMT-P8 va lliurar KLA amb èxit dins de les cèl·lules tumorals humanes i el pèptid interioritzat era funcional.

A continuació, per determinar si l’IMT-P8 pot translocar una molècula gran, vam triar GFP com a càrrega. La GFP no té la capacitat d’interioritzar-se per si sola a la cèl·lula i és endogenament fluorescent; per tant, la localització in vitro i in vivo es pot controlar fàcilment. Citometria de flux i estudis confocals amb HeLa (Fig. 4E), RWPE-1 i cèl·lules PC3 (dades no mostrades) tractades amb IMT-P8-GFP van confirmar que IMT-P8 és capaç de lliurar GFP a les cèl·lules fins i tot després de 30 minuts com a es va observar fluorescència significativa de GFP en aquestes línies cel·lulars. En l'estudi anterior, es va observar que la presa d'IMT-P8 era significativament superior al TAT, un CPP àmpliament utilitzat. Aquí també, l’absorció d’IMT-P8-GFP va ser significativament superior a la TAT-GFP. El mecanisme d’absorció d’IMT-P8-GFP se suposa que era similar a l’IMT-P8 ja que es va observar una fluorescència citoplasmàtica puntual en cèl·lules HeLa tractades tant amb IMT-P8-GFP com amb IMT-P8. Amb tots aquests resultats, es pot concloure que IMT-P8 és capaç de transportar càrregues de diferents mides que van des de molècules petites com FITC i petits pèptids fins a grans macromolècules.

Atès que els pèptids són inestables al tracte gastrointestinal i no es poden administrar per via via 40 . Per tant, la majoria de formulacions basades en CPP només es poden administrar per via intravenosa, la qual cosa és invasiva i, per tant, no és beneficiosa per als pacients, especialment quan es requereixen dosis repetitives. L’ideal seria que un sistema de lliurament de medicaments hagi de ser no invasiu, indolor, fàcil d’utilitzar i proporcionar un millor compliment del pacient. En aquest context, la ruta de lliurament transdèrmica ha captat una atenció tremenda durant els darrers anys. El lliurament transdèrmic de molècules terapèutiques ofereix nombrosos avantatges respecte al lliurament i la injecció orals convencionals. Tot i que el lliurament de la pell té un potencial enorme a causa de la gran superfície i la fàcil accessibilitat, és molt difícil, ja que la pell serveix de barrera d’autoprotecció i bloqueja la penetració de les molècules alienes. El teixit de la pell consta de les quatre capes diferents: estrat corneum, epidermis viable, dermis i teixit connectiu subcutani 11 . Entre aquestes, la capa més externa és la SC, que protegeix l’entrada de materials externs a la pell. En el passat recent, s’han fet esforços considerables per investigar el lliurament transdèrmic mediat per CPP de molècules terapèutiques com proteïnes 33, nanopartícules 61, àcid hialurònic 62, fàrmacs de molècules petites 27, siRNA 26, insulina 24, etc. En aquests estudis, CPPs S'ha trobat que millora la permeabilitat de molècules terapèutiques mitjançant l'administració local de la pell per tractar diverses malalties, incloses la psoriasi i la dermatitis atòpica.

Tenint en compte els resultats que demostren que l’IMT-P8 pot lliurar càrregues a les cèl·lules in vitro , a continuació es va intentar examinar si l’IMT-P8 és capaç de penetrar a la pell del ratolí i lliurar les càrregues a les capes de la pell in vivo . Després de 2 h d’aplicació tòpica, l’IMT-P8 va creuar el SC i es va acumular a l’epidermis. També es va observar poca acumulació de teixit dèrmic que suggereix que l’IMT-P8 pot penetrar a la pell (Fig. 5). Després de les 24 h, juntament amb l’acumulació a l’epidermis, es va observar una forta fluorescència verda a l’interior dels fol·licles pilosos que indica la presència d’IMT-P8 dins dels fol·licles pilosos (figura suplementària Fig. S2). Una observació similar es va veure quan les molècules de fusió, IMT-P8-GFP i IMT-P8-KLA van ser aplicades tòpicament que suggereixen que IMT-P8 és capaç de lliurar càrrega de proteïnes i pèptids a la pell. Anteriorment, Johnson LN et al. 63 han informat del lliurament tòpic de GFP mitjançant pèptid POD a la pell de ratolins. Han demostrat que després d’aplicació tòpica, POD-GFP es va acumular a l’epidermis i a l’interior dels fol·licles pilosos. Els nostres resultats estaven d'acord amb aquestes troballes anteriors.

El mecanisme pel qual la IMT-P8 es va interioritzar a la pell encara no està clar. Però sembla que el mecanisme per a la penetració de la pell de l’IMT-P8 és d’alguna manera diferent de la penetració de la membrana plasmàtica. Les cèl·lules canceroses IMT-P8 interioritzades mitjançant macropinocitosi, però en el cas de la pell, la SC es compon de cèl·lules no viables i, per tant, no s’espera l’endocitosi. En el passat, s’han fet molts estudis sobre l’ús de petits pèptids per lliurar càrregues a la pell 21, 33, 34, 35 . Tanmateix, el mecanisme exacte del transport de pèptids a través de les capes de la pell no s’entén del tot. S’ha suggerit que els CPP rics en arginina com la TAT i l’oligoarginina tinguin una càrrega positiva neta elevada a causa de l’arginina. Després de la interacció amb les superfícies de les cèl·lules de la pell carregades negativament, es transporten a través de diverses capes de la pell mitjançant tres rutes principals, incloent-hi les rutes transcel·lulars, apèndixs i intracel·lulars (matriu extracel·lular) 11 . En el passat, s’han realitzat uns quants estudis informant de la localització / ruta de la petita penetració de pèptids a través de les capes de la pell. Chen Y et al. 24 han demostrat el lliurament d’insulina per pèptid TD-1 a través de la pell. En aquest estudi, els autors han demostrat l’acumulació d’insulina marcada amb FITC dins dels fol·licles pilosos després d’una aplicació tòpica que suggereix la implicació de la via transfollicular en el lliurament d’insulina mitjançant pèptid TD-1. En un estudi diferent, Johnson LN et al. 63 també han demostrat la penetració de POD-GFP als fol·licles pilosos. En el present estudi, també hem observat l’acumulació d’IMT-P8 a l’epidermis i als fol·licles pilosos, ja que es va observar una fluorescència verda important a l’epidermis i a l’interior dels fol·licles pilosos en mostres cutànies tractades amb IMT-P8, IMT-P8- KLA i IMT-P8-GFP. Per tant, basant-se en aquests resultats i sobre la base de troballes d’investigació anteriors d’altres estudis, es pot suggerir que l’IMT-P8 pugui penetrar a les capes de la pell mitjançant la via transfollicular. No obstant això, es requereixen estudis addicionals per comprendre el mecanisme (s) exacte (s) del transport intervingut per la pell per IMT-P8.

En resum, la investigació present demostra que l’IMT-P8 pot transportar una varietat de càrregues a diferents línies cel·lulars de càncer de manera més eficient que el pèptid TAT. A banda de la capacitat de penetració de cèl·lules in vitro , IMT-P8 també és capaç de penetrar el teixit de la pell in vivo i pot transmetre una gamma de molècules des de FITC a KLA fins a GFP a la pell del ratolí, cosa que fa que IMT-P8 sigui una molècula potencial de plom. per utilitzar-se en el tractament de diverses infeccions locals de la pell i diferents aplicacions cosmètiques.

Mètodes

Materials

La línia de cèl·lules humanes de càncer de coll uterí HeLa, la línia de cèl·lula de carcinoma de pròstata humana PC3, la línia de cèl·lules d'epiteli normal de la pròstata humana RWPE-1 i la línia cel·lular de càncer de mama MDA-MB-231 es van obtenir de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM), RPMI-1640, barreja de nutrients F12 de Ham, Keratinocytes-SFM, sèrum boví fetal (FBS), trypsina, penicilina, estreptomicina, Opti-MEM, solució tampó fosfat (PBS, pH 7, 4), MitoTracker Red CMXRos (marcador per a mitocondris), DAPI (marcador de nucli) i reactiu antifat es van comprar a Molecular Sondes (Eugene, OR). El reactiu MTT i altres reactius utilitzats per a la purificació i expressió de proteïnes es van comprar a Sigma. El kit d'assaig de proteïnes BCA es va comprar a Pierce. El cloramfenicol, la kanamicina i el lisozima es van comprar a Sigma. Tots els productes químics utilitzats eren de grau analític.

Síntesi de pèptids

La llista de pèptids utilitzats en el present estudi es resumeix a la taula 1. L’IMT-P8 es va sintetitzar a la instal·lació de síntesi de pèptids del nostre Institut de Tecnologia Microbiana, Chandigarh, Índia, mentre que els dos pèptids KLA i IMT-P8-KLA es van comprar a GL Biochem (Xangai, Xina). El pèptid IMT-P8 es va sintetitzar mitjançant una estratègia de síntesi de pèptids de fase sòlida mitjançant la química de Fmoc (N- (9-fluronil) -metoxicarbonil) a escala de 0, 01 mmoles a escala de sintetitzador de pèptids Protein Technologies Inc, EUA, PS-3, tal com es descriu en altres llocs 28 . Els pèptids es van marcar amb isotiocianat de fluoresceïna (FITC) mitjançant un enllaç d'amino hexanoic àcid (ahx) en el terminal N.

Taula completa

Construcció de plàsmids

La regió codificadora GFP es va amplificar a partir del plasmidi pEGFP-c1 (Clontech, EUA) i es va clonar als llocs NdeI i BamHI del vector d'expressió pET28a. TAT-GFP i IMT-P8-GFP es van amplificar per PCR i es van clonar al lloc NdeI i XhoI dins del lloc de multi-clonació d’un vector d’expressió, pET23a mitjançant parells d’oligonucleòtids (taula suplementària S2). Això va donar lloc a les proteïnes esmentades de longitud completa amb una etiqueta C-terminal His 6. Totes les construccions es van verificar mitjançant la seqüenciació de l’ADN.

Purificació de proteïnes recombinants

Per a la producció i purificació de proteïnes, les cèl·lules BL21DE3star de E. coli (pLysS) (Invitrogen) es van transformar amb les construccions esmentades anteriorment i es van expressar en proteïnes solubles. Les cèl·lules transformades es van cultivar durant la nit i es va utilitzar aquest estoc per inocular més 1000 ml de brou de LB que contenia 50 μg / ml de kanamicina i 34 μg / mL de cloramfenicol. Les cèl·lules es van cultivar a 37 ° C en un agitador incubador a 200 rpm a un A 600 de 0, 6 i es va induir l'expressió de proteïna amb IPTG d'1 mM. Es van cultivar també durant 4 hores a 37 ° C i es van collir per centrifugació. La pellet cel·lular es va tornar a suspendre en tampó A (20 mM Na + fosfat fosfat, pH 7, 2 i NaCl 300 mM) contenint 0, 1 mg / ml lisozima i es va incubar en gel durant 30 minuts. Tots els procediments posteriors es van realitzar a 4 ° C. La suspensió cel·lular va ser sonicada i el sobrenedant es va recollir després de centrifugar a 11000 g durant 60 min. Com que les proteïnes d'interès eren construccions de fusió GFP / GFP, es va poder constatar visualment la seva presència en els diversos passos del protocol. El sobrenedant es va passar per comptes de agarosa Ni-NTA equilibrats (3 ml de purina al 50%). Va ser seguit per 5 volums de columnes de rentat amb tampó A que contenia 30 mM imidazol per eliminar proteïnes no especificades. Les proteïnes es van eluir en 10 mL tampó A que contenia 300 mM imidazol. Per eliminar l'imidazol, les proteïnes eluïdes es van afegir per separat als concentradors de proteïna Amicon i es va intercanviar el tampó tres vegades utilitzant el tampó A sol (sense imidazol). Finalment, les proteïnes es van concentrar cinc vegades i el volum va disminuir a 2 ml. Aquestes proteïnes es van quantificar mitjançant el kit d’assaig de proteïnes BCA (Pierce). Aquest protocol produïa ~ 3-4 mg de proteïna cadascun de GFP, TAT-GFP i IMT-P8-GFP. Les proteïnes es van alliberar i es van emmagatzemar a -80 ºC fins a un altre ús.

Cultiu cel·lular

Les cèl·lules PC3 i MDA-MB-231 es van cultivar en medi RPMI complementat amb FBS al 10% (Gibco) i L-glutamina (2 mM). Les cèl·lules HeLa es van cultivar en DMEM, complementades amb 10% FBS i 1% d’antibiòtics de penicil·lina / estreptomicina (Gibco). Les cèl·lules RWPE-1 es van cultivar en el medi queratinòcit-SFM (Gibco) complementat amb el factor de creixement de l'epidermia recombinant humà (Gibco) i l'extracte de pituïtària bovina (Gibco). Totes les cèl·lules es van mantenir a 37 ° C en una atmosfera humidificada al 5% de CO 2 .

Quantificació de la captació cel·lular

Per quantificar la captació de proteïnes de fusió CPP-GFP (TAT-GFP, IMT-P8-GFP) i pèptids marcats amb FITC (KLA i IMT-P8-KLA), es van plantar cèl·lules HeLa (2, 0 × 10 5 per pou). 37 ° C en plaques de 24 pous aproximadament 24 hores abans de l’inici dels experiments. A continuació, es van rentar les cèl·lules amb PBS i es van incubar amb proteïnes de fusió CPP-GFP (5 μM durant 1 h) o pèptids marcats amb FITC (2, 5 μM cadascun durant 30 min) en un medi OptiMEM a 37 ° C. Després del tractament anterior, les cèl·lules es van rentar amb PBS dues vegades per eliminar l'excés de pèptids extracel·lulars no units. Posteriorment, les cèl·lules es van esbandir dues vegades amb heparina (100 μg / ml) i es van incubar amb trypsina (1 mg / ml) durant 10 min per eliminar pèptids o proteïnes unides a la superfície no interioritzades. Després d'això, es van centrifugar les cèl·lules a 1000 rpm durant 5 min, es van rentar i finalment es van suspendre en PBS. La intensitat de fluorescència FITC de pèptids o proteïnes interioritzades en cèl·lules vives es va mesurar per citometria de flux utilitzant el citòmetre de flux Accuri C6 (BD Biosciences) mitjançant l'adquisició de 10.000 cèl·lules vives. Les experiències es van realitzar dues vegades per triple. Les dades es van obtenir i analitzar mitjançant CFlow Sampler (BD Biosciences). Les barres d'error indiquen l'error estàndard i les cel·les no tractades només en els suports van ser utilitzades com a controls.

Microscòpia de rastreig làser confocal

Per visualitzar la distribució de pèptids interioritzats marcats amb FITC i proteïnes de fusió IMT-P8-GFP, es van sembrar cèl·lules HeLa (1 × 10 cèl·lules 5 ) en 12 plaques de pous que contenien copes de vidre de 16 mm, 24 h abans de la incubació amb marcatge FITC pèptids o IMT-P8-GFP. Després de l’adhesió completa, el medi de cultiu cel·lular es va substituir per un medi fresc que contenia pèptids marcats amb FITC (2, 5 μM) i IMT-P8-GFP (5 μM), i després es van incubar les cèl·lules a 37 ° C durant 30 min. Les cèl·lules no es van arreglar per evitar la localització artificial del pèptid interioritzat. Al final del període d'incubació, es va eliminar el medi de cultiu i es van rentar els folis de cobertura a fons amb PBS durant 3-5 minuts (tres vegades) i es van muntar en diapositives de vidre amb el reactiu antifat. La localització de pèptids marcats amb FITC i IMT-P8-GFP a les cèl·lules vives (sense fixar) es va analitzar immediatament mitjançant el microscopi confocal Nikon A1R.

Per a estudis de co-localització, les cèl·lules HeLa, cultivades sobre cobertures, van ser incubades amb MitoTracker Red CMXRos (100 nM) juntament amb FITC-IMT-P8 i FITC-IMT-P8-KLA (2, 5 μM) en un medi sense sèrum durant 30 min. a 37 ° C. A continuació, es van rentar les cèl·lules tres vegades amb PBS i es van examinar immediatament mitjançant el microscopi confocal.

Assaig de viabilitat cel·lular

La viabilitat cel·lular es va determinar mitjançant el test MTT. Breument, es van sembrar cèl·lules (HeLa, PC3 i MDA-MB-231) a una densitat de 5 × 10 3 cèl·lules / pou en plaques de microtitre de 96 pous en suplement suplementat amb 10% de FBS 24 h abans de l'inici de l'experiment. Les cèl·lules es van incubar amb diferents concentracions (5, 10 i 20 μM, respectivament) de pèptids no marcats durant 24 hores. Les cèl·lules de control no van rebre cap tractament de pèptids. Al final del període d’incubació, es va analitzar el creixement cel·lular mitjançant l’addició de 20 µl de MTT (5 mg / ml; Sigma-Aldrich) a cada pou, i la placa es va incubar a 37 ° C durant 4 hores. Posteriorment, es va extreure amb cura el medi, es van afegir 200 µl DMSO i es va barrejar i es va llegir l’absorbància a 570 nm amb un lector de plaques (Bio-Rad). La supervivència de les cèl·lules respecte al control (cèl·lules incubades amb un medi de creixement que no conté cap pèptid) es va calcular prenent la relació de l’absorbància a valors de 570 nm. Tots els experiments es van realitzar per triplicats.

Declaracions d'ètica i d'animals

Els ratolins BALB / c masculins de 6 a 8 setmanes d’edat i amb un pes de 22 a 25 g es van obtenir de la Animal Facility of Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh. Els ratolins es van allotjar en gàbies individuals en condicions estàndard (temperatura a 22 ± 2 ° C, 12 h de llum / cicle fosc) i es van alimentar amb dieta normal de pellets i aigua ad libitum. Tots els protocols sobre ratolins van ser aprovats pel Comitè d’Ètica Animal de l’aprovació àmplia IMTECH núm. IAEC / 13/21. All experiments on animals were performed as per the guidelines of the Committee for the Purpose of Supervision of Experiments on Animals (CPCSEA), national regulatory body for experiments on animals, Ministry of Environment & Forests, India. Proper care was taken to minimize pain and suffering of mice.

In vivo skin delivery of KLA and GFP by IMT-P8

Topical delivery of GFP and KLA by IMT-P8 was evaluated on mice skin. The overall procedure is shown in Supplementary Fig. S1. Briefly, one day prior to topical application, a small region (2 × 2 cm) on the lateral sides of the abdomen of mice was shaved. Proper care was taken to prevent any damage to mouse skin while shaving. Next day, animals were anesthetized with xylazine/ketamine and 15 μl (stock 1 mM each) of FITC labeled IMT-P8, TAT, KLA, IMT-P8-KLA (n = 4) in PBS or 30 μg of each of the recombinant proteins (GFP, TAT-GFP, and IMT-P8-GFP) were applied to the shaved surface of abdominal skin (n = 6). GFP and PBS were applied to mouse skin as a control. In the case of peptides, the skin was harvested after 2 and 24 h whereas in the case of recombinant proteins it was harvested after 4, 12 and 24 h. However, the data was shown only for 24 h in the case of recombinant proteins. Before harvesting, skin was cleaned with 70% isopropyl alcohol just to remove the surface adsorbed peptide and immediately skin biopsies were fixed overnight in ice cold 4% formaldehyde. Thereafter, these skin samples were washed and immersed in 4.5% sucrose solution for 24 h followed by dehydration in 30% sucrose till deposition. Vertical cryosections (20 μm thickness) were obtained on a freezing microtome (Leica). Cryosections were mounted onto poly-L-lysine coated glass slides in 10 μl of mounting medium (Invitrogen). The skin sections were imaged on the confocal microscope (Nikon). For quantification of mean fluorescence, confocal images were analyzed using software ImageJ (//ImageJ.nih.gov/ij/) developed by National Institutes of Health. Identical regions of each image were measured for each application. ImageJ converts image pixels into brightness values (arbitrary units). Surface plots were developed and brightness values of all the images were measured and represented as mean fluorescence.

Anàlisi estadística

Statistical significance of the differences was determined by the two-tailed Student t-test using Microsoft Excel software. Els valors de P <0, 05 es van considerar estadísticament significatius.

Informació adicional

How to cite this article : Gautam, A. et al. Topical Delivery of Protein and Peptide Using Novel Cell Penetrating Peptide IMT-P8. Cci. Rep. 6, 26278; doi: 10.1038/srep26278 (2016).

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària

Comentaris

En enviar un comentari, accepteu complir els nostres Termes i Directrius de la Comunitat. Si trobeu alguna cosa abusiva o que no compleix els nostres termes o directrius, marqueu-la com a inadequada.