La proteïna del domini tudor phf20l1 llegeix la lisina proteïna supressora de tumors retinoblastoma metilada | diferenciació i defunció cel·lular

La proteïna del domini tudor phf20l1 llegeix la lisina proteïna supressora de tumors retinoblastoma metilada | diferenciació i defunció cel·lular

Anonim

Temes

  • Biologia cel·lular
  • Trastorns neurològics
  • Neurociència

Resum

La proteïna supresora del tumor del retinoblastoma (pRb) funciona clàssicament per regular la progressió del cicle cel·lular precoç, on actua per fer complir diversos punts de control en resposta a l'estrès cel·lular i el dany en l'ADN. La metilació a la lisina (K) 810, que es produeix dins d'un lloc crític de fosforilació CDK i antagonitza un esdeveniment de fosforilació dependent de CDK al residu veí S807, actua per mantenir pRb en ​​l'estat de supressió del creixement hipo-fosforilat. Això està mediat en part pel reclutament de la proteïna lector 53BP1 a K810 di-metilat, cosa que permet que l'activitat de pRb s'integri efectivament amb la resposta de danys en l'ADN. Aquí, informem de la sorprenent observació que a K810 es produeix una interacció addicional de la metilació, però en lloc de la marca di-metil, és selectiu per a la marca mono8-metil K810. La unió del lector mono-metil PHF20L1 al pRb metilat es produeix en els gens objectiu E2F, on actua per mediar un nivell addicional de control mitjançant la contractació del complex d'acetiltransferasa MOF als gens objectiu E2F. De manera significativa, trobem que la interacció entre PHF20L1 i mono-metil pRb és important per mantenir la integritat d’un punt de control de fase G1 – S depenent de pRb. Els nostres resultats posen de manifest els diferents papers que tenen els lectors de metil-lisina en la regulació de l’activitat biològica de la pRb.

Principal

pRb és el supressor arquetípic de tumors que està directament mutat o el seu producte proteic inactivat funcionalment en la gran majoria dels tumors humans. 1 Se li han assignat moltes funcions, però un dels seus papers primordials és regular la transcripció de gens sensibles a l'E2F connectats amb la progressió del cicle cel·lular, la replicació de l'ADN i altres destins cel·lulars, inclosa l'apoptosi i la diferenciació. 2 Aquesta regulació està mediada per una interacció directa entre pRb i el domini d’activació transcripcional de certs factors de transcripció E2F, com E2F-1, que dificulta la transcripció i produeix la inhibició del creixement. 3, 4 pRb també media la repressió activa reclutant proteïnes que modulen l'estructura de la cromatina, incloent histona desacetilases, histona metiltransferases i factors de remodelació de la cromatina. 2

L’activitat del pRb i la seva interacció amb la família E2F es regeix a si mateixa per diverses modificacions post-traduccionals (PTM). 5 A les cèl·lules ciclistes, l'activitat de pRb es modula per l'activitat dels complexos ciclina-CDK, que fosforilen pRb per induir l'alliberament de factors de transcripció d'E2F. pRb també pot patir PTM addicionals, inclosa l'acetilació i la metilació de la lisina, que afecten encara més l'activitat del pRb. 5, 6, 7, 8 En particular, la metilació de pRb en ​​el residu K810 per l’enzim SET7 / 9 (SETD7) promou l’estat de pRb hipo-fosforilat que suposa el creixement. Mecànicament, això es produeix interferint en l'associació entre complexos ciclina-CDK i pRb. La fosforilació CDK es produeix en el motiu SPX K / R, on K810 actua com a residu bàsic essencial al lloc de consens de CDK centrat en S807 (SPL K ). A més, el K810 metilat és "llegit" pel domini tudor tàndem que conté proteïna 53BP1, 9, una proteïna sensible al dany de l'ADN que també pot interactuar amb H4K20 metilat i que participa en la reparació de ruptures de doble cadena d'ADN (DSBs) mitjançant un extrem no homòleg. unió (NHEJ). En el context de la seva interacció amb pRb, 53BP1 integra la resposta de danys a l'ADN amb el control del cicle cel·lular mediat per pRb. De fet, la família de proteïnes del retinoblastoma també ha estat directament implicada en la reparació del DNA mitjançant la seva interacció amb components addicionals del NHEJ com XRCC5 i XRCC6. 11

La proteïna PHD-finger 1 de tipus 20 (PHF20L1) està relacionada amb càncers de mama i d’ovari, on es descriuen les amplificacions gèniques i les aberracions en nombre de còpia. La proteïna 12, 13, 14 PHF20L1 conté dos dominis tudor, que han estat descrits per interactuar amb els residus de lisina mono-metilats en H3K4, H4K20 15 i ADN metiltransferasa-1 (DNMT1). 16 A més, PHF20L1 és un component d’un complex proteic conservat evolutivament que conté l’ortòleg humà dels homes d’acetiltransferasa absents en el primer (MOF). 17 A les cèl·lules humanes, els complexos que contenen MOF són els responsables de l'acetilació d'histona H4K16, 18 que s'ha implicat com a marca clau en la regulació transcripcional. L’activitat 19, 20, 21, 22 del MOF també s’ha relacionat amb múltiples etapes de la resposta al dany de l’ADN, ja que la pèrdua d’acetilació de MOF i H4K16 condueix a una sensibilitat a la radiació ionitzant i a una reparació defectuosa del dany a l’ADN en ratolins i línies cel·lulars humanes. 23, 24

En aquest informe, elucidem un nivell inesperat de control depenent de la metilació sobre K810 pRb, en què la marca mono-metil és llegida per PHF20L1, en contrast amb 53BP1 que llegeix la marca di-metil K810. De manera significativa, el reclutament depenent de la metilació de PHF20L1 a K810me és necessari per a la recuperació adequada de les cèl·lules del control de punts de control mediada per pRb, permetent-les tornar a entrar en el cicle cel·lular. La interacció de PHF20L1 amb pRb permet el reclutament del complex acetiltransferasa de la MOF als gens objectiu E2F. Els nostres resultats posen de manifest el paper dels lectors de metil en el control de la biologia de pRb i posen de manifest el potencial interacció entre els lectors de la marca de metil i les acetiltransferases en la regulació del cicle cel·lular.

Resultats

PHF20L1 la llegeix la metilació de la lisina pRb

El residu K810 en pRb és un residu crític en el control del creixement que depèn del pRb. 8 Hem utilitzat pèptids biotinilats pRb per seleccionar la matriu de dominis associada a la cromatina (CADOR), una plataforma desenvolupada per identificar dominis proteics que uneixen els pèptids modificats, que inclou tudor, MBT, PHD i cromodominis, 25 i anteriorment utilitzats per identificar 53BP1. 9 Quan es va realitzar aquesta pantalla amb un pèptid monocromat K810 pRb mono-metilat, es va identificar la proteïna de domini tudor PHF20L1 (figura 1b). Significativament, vam confirmar que la interacció entre PHF20L1 i pRb era depenent de la metilació mitjançant un assaig d’enllaç de pèptids in vitro , i vam establir que el tudor 1 de PHF20L1 es va unir preferentment a un pèptid metilat (RbK810me1) (figura 1c). Si bé el tudor 1 de PHF20L1 podia interaccionar tant amb mono i di-metil K810, va mostrar una eficiència d'unió més forta cap al pèptid mono-metilat i no va poder unir el pèptid tri-metilat de K810 (figura 1d). Aquesta observació es va confirmar per interferometria de dos capes (BLI), que va tornar a posar de manifest una preferència pel pèptid RbK810me1 (figura 1e), amb una constant de dissociació de 28 μ M (figura 1f). D'altra banda, l'ús d'una proteïna PHF20L1 de longitud completa (que conté dominis tudor 1 i tudor 2) va mostrar un K D similar de 34 μ M, indicant que el segon domini tudor de PHF20L1 no contribueix significativament a la interacció amb RbK810me1 (figura suplementària S1b ). De fet, quan els dominis tudor de PHF20L1 es van expressar individualment i es van utilitzar en un assaig d’enllaç de pèptids in vitro , només el tudor 1 es va unir a RbK810me1, mentre que el domini tudor 2 no (figura 1g). Els dominis tudor de la proteïna PHF20 estretament relacionada mostraven una unió mínima a RbK810me1, tant en el assaig d’unió a pèptids com en la matriu CADOR (figures 1g i b), demostrant que la interacció metil-pRb era específica per a un domini tudor únic en PHF20L1.

Image

Identificació d’una nova proteïna lector per a pRb metilat a K810. ( a ) Representació esquemàtica de proteïnes pRb i PHF20L1. La seqüència d'aminoàcids al voltant del residu K810 (en vermell) s'amplia per indicar el motiu de consens CDK SPLK (en caixa). S'indica una interacció dependent de metil amb el domini tudor 1 de PHF20L1. La seqüència d'aminoàcids de PHF20L1 entre els residus 18 i 53 es mostra per posar en relleu els residus del domini tudor 1 importants per al reconeixement de metil-lisina (*). També es indiquen els residus D23 i F47 mutats en alanina en aquest estudi. ( b ) matriu CADOR sondada amb anti-GST (superior), RbK810me0 biotinilat (mig) o RbK810me1 biotinilat (inferior). Les regions de caixes grises marcades mostren la unió del pèptid pRb metilat al domini tudor 1 de PHF20L1. Els punts verds addicionals representen la interacció descrita anteriorment amb 53BP1. ( c ) Ensenyament d'unió a pèptids en què es va incubar el pèptid RbK810me0 o RbK810me1 amb un tudor recombinant GST-PHF20L1 1. La part esquerra mostra un flux a través del assaig, mentre que el costat dret mostra la resta de proteïnes eluïdes. n = 3. ( d ) Com anteriorment, encara que es van utilitzar els pèptids RbK810me0, -me1, -me2 i -me3. n = 2. ( e ) Anàlisis cinètics en interferometria biotecnològica en temps real dels pèptids RbK810me0 immobilitzats, -me1, -me2 i -me3 lligats als tudor His-PHF20L1 1. ( f ) Com s'ha indicat anteriorment, però mostrant la unió depenent de la concentració de PHF20L1 tudor 1 amb el RbK810me1 pèptid. A partir d’aquestes dades es va calcular un valor K D de 28 μ M. ( g ) Anàlisi de la unió a pèptids en què es van incubar els pèptids RbK810me0 o RbK810me1 amb GST-PHF20 recombinant (tudor 1, tudor 2 o tudor 1 + 2) o GST-PHF20L1 (tudor 1, tudor 2 o tudor 1 + 2). n = 3

Imatge a mida completa

A continuació, vam expressar pRb i PHF20L1 en cèl·lules SAOS2 (defectuoses per a pRb), on es va fer evident una interacció entre pRb de tipus salvatge, però no el mutant lisina-arginina (K810R), amb PHF20L1 (figura 2a). La interacció es va confirmar utilitzant una línia cel·lular CRISPR pRb U2OS, en la qual pRb de tipus salvatge o el mutant K810R s’havien reintroduït i expressat ectòpicament de manera estable. Es va observar que pRb co-immunoprecipitava amb PHF20L1 endògena, mentre que la interacció entre PHF20L1 i el mutant K810R es va reduir significativament (figura 2b). A més, la interacció va requerir la integritat del primer domini tudor de PHF20L1, ja que dos derivats mutants (D23A i F47A; Figura 1a) que contenien substitucions en residus conservats importants per al reconeixement de metil-lisina 26 no van poder interactuar amb pRb (figura 2c). De fet, en un assaig d’interacció in vitro , mentre que el tudor 1 de tipus salvatge PHF20L1 interaccionava amb un pèptid RbK810me1, el mutant D23A no (Figura 2d). També vam provar la possibilitat que el reclutament de PHF20L1 a RbK810me1 fos influenciat en condicions de dany de l'ADN, perquè estudis anteriors van posar de relleu la lectura dependent de l'ADN de di-metil K810 per 53BP1. 8, 9 Tot i això, les cèl·lules tractades amb etoposidi mostraven una modesta reducció de l’eficiència en la interacció entre PHF20L1 i pRb en ​​comparació amb cèl·lules no urbanitzades (Figura 2a), cosa que indica que la lectura de PHF20L1 del succés mono-metil no està influenciada per danys en l’ADN.

Image

El domini tudor 1 de PHF20L1 mostra especificitat per RbK810me1. ( a ) Les cèl·lules SAOS2 es van transfectar amb 3 μ g de HA-pRb / HA-pRb-K810R i 1 μ g de Flag-PHF20L1 / vector buit tal com es va indicar. També es va tractar les cèl·lules amb 20 μ M etoposide durant 16 h, si escau. Es va realitzar una immunoprecipitació mitjançant agarosa anti-bandera i es va detectar pRb co-precipitant per immunoblot. Els nombres que apareixen a sota de la indicació indiquen la quantitat relativa de pRb coimmunoprecipitat amb PHF20L1. n = 3. ( b ) Els extractes de les línies de cèl·lules CRISPR U2OS pRb transfectades de manera estable amb el vector buit ectòpic (-), HA-pRb o HA-pRb-K810R es van utilitzar en una immunoprecipitació amb agarosa anti-HA. Immunoblot es va analitzar la co-precipitació endògena de PHF20L1. Els nombres que apareixen a sota de la indicació indiquen la quantitat relativa de PHF20L1 co-immunoprecipitat amb pRb. n = 2. ( c ) Les cèl·lules SAOS2 es van transfectar amb 3 μ g de HA-pRb i 1 μ g de Flag-PHF20L1, Flag-PHF20L1 D23A o Flag-PHF20L1 F47A tal com es va indicar. Es va realitzar una immunoprecipitació amb agarosa anti-Flag i es va detectar pRb coimmunoprecipitant per immunoblot. ( d ) Assaig d'unió a pèptids en què es van incubar els pèptids RbK810me0 o RbK810me1 amb tudor 1 GST-PHF20 recombinant, tudor 1 GST-PHF20L1 o GST-PHF20L1 tudor 1 D23A. El costat esquerre mostra el flux a través del test, mentre que el costat dret mostra la resta de proteïnes eluïdes. n = 3

Imatge a mida completa

PHF20L1 recluta l'acetiltransferasa MOF a pRb mono-metilat

Com que PHF20L1 és un component del complex acetiltransferasa de la MOF en cèl·lules de mamífers, 17 vam provar la hipòtesi que PHF20L1 podria reclutar MOF a pRb metilat. Inicialment, es va examinar si pRb i MOF expressats ectòpicament podien co-immunoprecipitar-se a les cèl·lules U2OS. Si bé es va observar la MOF que interactuava amb pRb de tipus salvatge, l'associació amb el mutant K810R es va reduir (Figura 3a), demostrant que la metilació a K810 és important per a la mediació de la interacció pRb-MOF a les cèl·lules. Una vegada més, els danys d'ADN induïts pel tractament amb etoposides no semblen millorar l'eficàcia d'aquesta interacció (Figura 3a), respirant el resultat observat per a la interacció entre pRb i PHF20L1 (Figura 2a).

Image

PHF20L1 recluta MOF a pRb metilat. ( a ) Les cèl·lules U2OS es van transfectar amb 3 μ g de HA-pRb / HA-pRb-K810R i 1 μ g de Flag-MOF / vector buit tal i com s’indica. Les cèl·lules es van tractar amb 20 μ M etoposide durant 16 h, si escau. Es va realitzar una immunoprecipitació mitjançant agarosa anti-bandera i es va detectar pRb co-precipitant per immunoblot. Els nombres que apareixen a sota de la indicació indiquen la quantitat relativa de pRb coimmunoprecipitat amb el MOF. n = 2. ( b ) Ensaig d'interacció in vitro en què es van incubar 250 ng de His-PHF20L1 amb 250 ng de GST-MOF o GST. El seu-PHF20L1 es va immobilitzar en agarosa Ni-NTA i es va detectar immunofot co-precipitant. n = 3. ( c ) Anàlisi de la unió a pèptids en què es va incubar el pèptid RbK810me1 amb GST-MOF i His-PHF20L1 tal com es va indicar. El costat esquerre mostra el flux a través del test, mentre que el costat dret mostra la proteïna eluïda. n = 3. ( d ) Les cèl·lules U2OS van ser transfectades amb control de 20 nM o siRNA PHF20L1, seguides de 3 μ g de HA-pRb i 1 μ g Bandera-MOF / vector buit, tal com s’indica. Es va realitzar una immunoprecipitació mitjançant agarosa anti-bandera i es va detectar pRb co-precipitant per immunoblot. Els nombres que apareixen a sota de la indicació indiquen la quantitat relativa de pRb coimmunoprecipitat amb el MOF. n = 4. ( e ) Les cèl·lules U20S van ser transfectades amb 2 μ g de vector buit (-), Flag-PHF20L1 o Flag-MOF. Es va realitzar una immunoprecipitació amb anticorp anti-Flag i es va analitzar la cromatina mitjançant PCR mitjançant primers que van dirigir els promotors indicats. n = 3. ( f ) Les cèl·lules U2OS es van transfectar amb 2 μ g de Flag-PHF20L1 i Flag-MOF. Els extractes es van immunoprecipitar amb anticossos de control IgG o PHF20L1 (primer ChIP). La cromatina immunoprecipitada es va tornar a imunoprecipitar per segona vegada amb anticossos de control IgG o MOF, tal com s’indica (segon ChIP)

Imatge a mida completa

Després, vam provar si es pot produir una interacció directa entre PHF20L1 i MOF. Es va realitzar un assaig d’interacció in vitro utilitzant PHF20L1 marcat amb His a llarg termini recombinant i MOF marcat per GST, on es va observar unió específica entre les dues proteïnes (figura 3b). De la mateixa manera, en un assaig d’unió a pèptids in vitro , GST-MOF només es va reclutar al pèptid RbK810me1 immobilitzat en presència de His-PHF20L1 (Figura 3c). Finalment, per confirmar que PHF20L1 estava involucrat en el reclutament de MOF a pRb a les cèl·lules, vam realitzar un experiment d’immunoprecipitació en condicions d’esgotament de PHF20L1 mitjançant tractament de siRNA. Els resultats donen suport al paper de PHF20L1 en el reclutament de MOF a pRb a les cèl·lules, ja que mentre que una interacció pRb-MOF era evident sota el tractament siRNA controlat, la interacció es va reduir amb PHR20L1 siRNA, tant a les cèl·lules U2OS (Figura 3d) com a SAOS2 (Figura complementària S1c).

pRb es requereix per a la contractació eficient de PHF20L1-MOF als promotors de gens sensibles a l'E2F

Tenint en compte el paper de MOF en la regulació de l’expressió gènica i l’estructura de la cromatina i la seva desregulació en una gran varietat de càncers, 23 vam raonar que la seva interacció amb pRb mitjançant PHF20L1 seria un determinant important del control del creixement depenent de pRb. Inicialment, vam identificar tant PHF20L1 com MOF expressats ectòpicament mitjançant la immunoprecipitació de la cromatina (ChIP) en diversos gens objectiu E2F i pRb, incloent timidina quinasa (TK), E2F-1, CDC6, ciclina A2 (CCNA2) i timidilat sintasa ( TS) a les cèl·lules U2OS (Figura 3e). Observacions similars es van fer a la línia cel·lular de càncer de mama MCF-7 (Suplementary Figure S1d). L'associació promotora amb resposta a E2F no estava regulada per danys en l'ADN, ja que per ChIP, les cèl·lules tractades amb etoposides mostraven nivells similars de PHF20L1 i MOF com a cèl·lules no urbanitzades (figura suplementària S1e). Notablement, en una anàlisi seqüencial de ChIP, es van detectar PHF20L1 i MOF junts en un complex lligat a la cromatina en gens objectiu E2F incloent TK, CDC6 i CDC25A (Figura 3f).

Per determinar si el reclutament de PHF20L1 i MOF a promotors amb resposta a E2F va dependre de la presència de pRb, es va realitzar l’anàlisi ChIP en cèl·lules U2OS tractades amb pRb siRNA (Figura 4a). Com que no hem pogut detectar MOF endògena amb els anticossos comercials disponibles per ChIP, hem utilitzat la presència d’una marca dependent de MOF a la cromatina com a substitut per a la MOF mitjançant l’ús d’un anticòs que reconeixia la marca H4K16ac, tal com s’ha descrit en estudis anteriors. 27 També vam confirmar que els nivells d’H4K16ac reflectien la presència de MOF mitjançant la realització d’un CHIP H4K16ac en condicions de tractament amb siRNA de MOF, quan l’expressió de MOF reduïda es correlacionava amb H4K16ac reduïda (figura 4b). Com a control, vam provar l'efecte del tractament amb siRNA amb pRb, que va provocar una reducció de la quantitat de pRb associat a la cromatina en els TS i promotors de dihidrofolata reductasa (DHFR) (figura 4a). El més interessant, això va correspondre amb una reducció de l’associació promotora de PHF20L1 i H4K16ac endògens (figura 4a). Es va confirmar aquest resultat en un segon experiment amb ChIP, on es va comparar l’associació de cromatines de PHF20L1 i H4K16ac en les línies de cèl·lules CRISPR de tipus U2OS o U2OS pRb (Figura 4c). Una vegada més, l’absència d’expressió de pRb a les línies cel·lulars CRISPR es va correlacionar amb nivells reduïts tant de PHF20L1 com de H4K16ac en TS, CDC25A i promotors DHFR, cosa que indica que la contractació de PHF20L1-MOF a promotors amb resposta a E2F està mediada mitjançant un mecanisme depenent de pRb.

Image

El reclutament dependent de pRb de PHF20L1-MOF per a la cromatina de promotors amb resposta a E2F mitjançant l'anàlisi de ChIP. ( a ) Les cèl·lules U2OS van ser transfectades amb control de 20 nM o siRNA de pRb tal com es va indicar. Els extractes de cèl·lules es van inmunoprecipitar després amb anticossos controlant IgG, PHF20L1, pRb o H4K16ac, i la cromatina es va analitzar per qPCR mitjançant primers que van dirigir els promotors TS i DHFR. n = 3 ( b ) Les cèl·lules U2OS es van transfectar amb control de 20 nM o siRNA de MOF, tal com s’indica. Els extractes de cèl·lules es van immunoprecipitar després amb anticossos IgG control o H4K16ac control, i es va analitzar la cromatina per qPCR mitjançant primers que van dirigir els promotors indicats. n = 2. ( c ) Les cèl·lules CRISPR U2OS o U2OS pRb es van preparar per a l'anàlisi de ChIP i es van immunoprecipitar amb anticossos de control IgG, PHF20L1 o H4K16ac. La cromatina es va analitzar mitjançant qPCR mitjançant primers dirigits als promotors indicats. n = 2. ( d ) Les cèl·lules U2OS van ser transfectades amb control de 20 nM o siRNA de PHF20L1 tal com es indica. A continuació, es va realitzar la immunoprecipitació de cromatina mitjançant primers contra (i) CDC25A, (ii) TS o (iii) promotors de DHFR. n = 3

Imatge a mida completa

Hem realitzat altres experiments ChIP en cèl·lules U2OS tractades amb siRNA de PHF20L1, per determinar si PHF20L1 podria impactar recíprocament en el reclutament de pRb a promotors amb resposta a E2F (figura 4d). No obstant això, mentre que PHR20L1 siRNA va donar lloc a nivells reduïts de H4K16ac en els promotors provats, coherent amb la presència reduïda de MOF en els gens objectiu (Figura 4b), no va afectar la capacitat del pRb de localitzar-se en aquestes regions de cromatina. Així, tot i que el reclutament de MOF a promotors amb resposta a E2F depèn fortament de PHF20L1, PHF20L1 no és necessari perquè pRb localitzi cromatina. El reclutament de PHF20L1-MOF a promotors de TS i DHFR es va produir a causa de la capacitat de PHF20L1 de llegir pRb metilat (Figura 4a).

La pèrdua de PHF20L1 afecta la progressió del cicle cel·lular a les cèl·lules U2OS

Atès que PHF20L1 continua mal descrit, es va intentar examinar la localització subcel·lular de la proteïna al llarg de diferents etapes del cicle cel·lular. Com que no hem pogut tacar la proteïna endògena PHF20L1 amb els anticossos disponibles comercialment, hem utilitzat proteïna marcada amb FLAG expressada en cèl·lules U2OS sincronitzades a G1-S per tractament amb hidroxurea (Figura 5a). Les cèl·lules van ser llavors cultivades en medis nous per permetre la progressió del cicle cel·lular i es va controlar la localització de PHF20L1 durant les fases S i G2 / M. En tots els casos, es va observar que la ectòpica PHF20L1 tenia una localització nuclear (figura 5a). També es va examinar l'efecte del dany d'ADN induït per l'etoposide, tot i que el senyal PHF20L1 va romandre nuclear en aquest context (figura 5a i figura suplementària S2b).

Image

Caracterització de PHF20L1 en cèl·lules. ( a ) Les llavors de les cèl·lules U2OS van ser plantades sobre llavis i transfectades amb 1 μ g de Flag-PHF20L1. Les cèl·lules també es van tractar amb 20 μ M etoposide o 1 mM hidroxiua durant 24 h, on es va indicar. En alguns casos, les cèl·lules van ser alliberades del bloc hidroxiurea durant els punts de temps indicats. Les cèl·lules es van fixar i es van preparar per a la immunofluorescència. A la figura suplementària S2a s'inclou un anàlisi de citometria de flux de cèl·lules per demostrar la sincronització cel·lular. ( b ) Les cèl·lules U2OS es van transfectar amb siRNA de control de 20 nM (C), o PHF20L1 (P) dirigit a siRNA. Les cèl·lules es van preparar per a l'anàlisi de citometria de flux. També es va realitzar un immunoblot per controlar els nivells de proteïnes d’entrada. n = 5. ( c ) Com anteriorment, tot i que les cèl·lules es van tractar durant 24 hores amb 2 μ M PD0332991 (inhibidor de Cdk4 / Cdk6). n = 3

Imatge a mida completa

Per obtenir més informació funcional, posteriorment es va examinar l'efecte del tractament amb siRNA PHF20L1 en el perfil del cicle cel·lular de cèl·lules U2OS (pRb de tipus salvatge). Els nivells reduïts de PHF20L1 van provocar un descens de la població de cèl·lules G1 observada, amb un augment concomitant en el percentatge de cèl·lules en fase S i G2- / M (figura 5b). Curiosament, el tractament de les cèl·lules amb PD0332991, un inhibidor específic de CDK4 / CDK6 que indueix la hipofosforilació pRb a les cèl·lules, 29 va abrocar l’efecte de PHF20L1 siRNA sobre la distribució del cicle cel·lular (figura 5c). Aquests resultats posen de manifest la possibilitat que l’efecte cel·lular de PHF20L1 estigui influït per l’estat de fosforilació de pRb.

El control del cicle cel·lular mitjançant PHF20L1 està mediat en part per un mecanisme depenent de pRb

A continuació, vam decidir examinar més si l’efecte cel·lular de PHF20L1 depenia de la integritat de pRb. A aquest efecte, vam comparar U2OS i les seves línies de cèl·lules CRISPR pRb per identificar les condicions cel·lulars on pRb va tenir un impacte en la regulació del cicle cel·lular. Hem observat que les línies cel·lulars CRISPR pRb mostraven una distribució diferent del cicle cel·lular després de l’alliberament d’un tractament amb hidroxurea en comparació amb les cèl·lules isogèniques de control U2OS. Concretament, les cèl·lules CRISPR pRb van mostrar una proporció més alta de cèl·lules en fase S després del tractament amb hidroxurea, mentre que les cèl·lules U2OS de tipus salvatge mostraven moltes cèl·lules restants a la G1 (figura suplementària S2c). Això era d’acord general amb un informe anterior, on la inactivació de pRb millorava el nombre de cèl·lules en fase S després de l’alliberament d’hidroxurea. 30 Per tant, hem utilitzat aquestes condicions per a realitzar estudis de co-esgotament mediats per siRNA (Figura 6a) o per examinar l'impacte de PHR20L1 siRNA sobre les línies de cèl·lules CRISPR de U2OS pRb (Figura 6b).

Image

Impacte de PHF20L1 i pRb sobre la progressió del cicle cel·lular. ( a ) (i) Les cèl·lules U2OS es van transfectar amb siRNA (C) de control de 20 nM, o PHF20L1 (P), pRb (R) o amb una combinació d'ambdues (PR) de control de siRNA. Algunes cèl·lules es van tractar 24 h amb 1 mM d’hidroxurea i es van alliberar durant 2 h. Les cèl·lules es van etiquetar amb BrdU i es van preparar per a l’anàlisi de citometria de flux. (ii) Es va calcular i mostrar el canvi percentual total de cèl·lules positives de BrdU entre les mostres tractades amb hidroxurea i les mostres alliberades. (iii) Es va realitzar un immunoblot per controlar els nivells de proteïnes d’entrada. n = 2. ( b ) (i) Els perfils representatius del cicle cel·lular extrets d’un experiment d’anàlisi de citometria de flux en el qual les línies de cèl·lules CRISPR (Rbcr) U2OS o U2OS pRb van ser transfectades amb control de 20 nM siRNA (C) o siRNA dirigit a siRNA PHF20L1 (P). Les cèl·lules es van tractar 42 hores amb 1 mM d’hidroxurea i algunes van alliberar-se durant 8 h. Els nombres indiquen el percentatge mitjà de cèl·lules en fases S + G2 / M a partir de les repeticions tècniques dins d'aquest experiment representatiu, amb la SD mostrada. Les proves t de l' estudiant realitzades a partir de rèpliques biològiques independents van indicar que la diferència entre la mostra de siRNA de control U2OS i la mostra de SiRNA U2OS PHF20L1, siRNA de control CRISPR pRb o pRb CRISPR PHF20L1 siRNA eren totes estadísticament significatives ( P <0.02). (ii) Es va calcular i mostrar el canvi percentual total de cèl·lules en fases S + G2 / M entre mostres tractades amb hidroxiurea i mostres alliberades. (iii) Es va realitzar un immunoblot per controlar els nivells de proteïnes d’entrada. n = 3. ( c ) Model de muntatge PHF20L1-MOF amb pRb metilat sobre cromatina. En resposta a la mono-metilació de pRb, PHF20L1 es recluta a pRb unit a la cromatina, on actua per regular un punt de control de la fase G1-S depenent de pRb. Aquest punt de control implica probablement l’activitat de l’acetiltransferasa del complex MOF recrutat, que pot orientar H4K16 als promotors de gens responsius a l’E2F (i). En absència de PHF20L1 (ii) o pRb (iii), es perd aquesta resposta de punt de control i les cèl·lules entren en fase S de manera inapropiada

Imatge a mida completa

Es va controlar el percentatge de cèl·lules sotmeses a síntesi d'ADN mitjançant l'examen de la incorporació de BrdU (figura 6a). Mentre que les cèl·lules tractades amb siRNA mostraven un augment en la tinció de BrdU del 0, 85 al 39, 2% després de l'alliberament d'hidroxurea, les cèl·lules tractades amb PHF20L1 o pRb siRNA van demostrar un augment molt més gran de cèl·lules positives amb BrdU (en comparació amb el tractament control) després de l'alliberament hidroxiurea (+ 64, 9% i + 66, 05%, respectivament) (figura 6ai i ii). És important destacar que no es va fer evident un efecte addicional en el cop esgotament tant de pRb com de PHF20L1 (figura 6a), la qual cosa dóna suport a la hipòtesi que pRb i PHF20L1 medien els seus efectes a través d'una ruta compartida.

Per examinar més el paper de pRb i PHF20L1 en la progressió del cicle cel·lular, els nivells de PHF20L1 es van reduir en les línies de cèl·lules CRISPR U2OS i U2OS pRb mitjançant tractament amb siRNA, i la progressió del cicle cel·lular es va supervisar per citometria de flux (figura 6b). La línia de cèl·lules CRRPRPR pRb va demostrar un canvi important cap a una població en fase S + G2- / M després de l'alliberament d'hidroxurea (+ 46, 86%), en comparació amb les cèl·lules U2OS parentals (+ 27, 00%) que encara conservaven un nombre més gran de G1. cèl·lules (figura 6b). Curiosament, també es va produir un canvi cap a una població en fase S + G2- / M en cèl·lules U2OS tractades amb siRNA PHF20L1 (+ 36, 02%). Quan es va tractar la línia cel·lular pRb CRISPR amb PHR20L1 siRNA, una gran proporció de cèl·lules s’havien traslladat a fases S o G2 / M (+ 50, 24%), tot i que és important tenir en compte que l’impacte de siRNA PHF20L1 es va reduir en el CRPPR pRb cèl·lules en comparació amb els U2OS parentals. Concretament, l’augment del 9, 02% de les cèl·lules en fase S + G2 / M observades entre PHF20L1 i les cèl·lules U2OS tractades amb SiRNA de control es va reduir fins al 3, 38% en condicions similars en la línia de cèl·lules CRISPR pRb (Figura 6bii). El fet que l’efecte cel·lular d’esgotar PHF20L1 es redueixi en absència de pRb (Figures 6a i Figures 6b) és coherent amb PHF20L1 i pRb que actuen a través de mecanismes de sobreposició i és compatible amb la interacció física entre PHF20L1 i mono-metil K810 pRb (Figura 2a).

Discussió

Una de les funcions més importants per a la proteïna pRb a les cèl·lules és regular la transició de la fase G1 a la fase S, i aquesta activitat és mediada en part modulant l’activitat dels factors de transcripció E2F. 2, 3 La vinculació directa de pRb a E2F coincideix amb una inhibició de la transcripció i l’aturada del cicle cel·lular, tot i que el reclutament d’enzims modificadors de la histona per pRb també contribueix a aquest efecte. 2 El reclutament d'aquests complexos sol implicar el reconeixement de PTM, que actuen com a llocs d'ancoratge de proteïnes que contenen dominis lectors. 15 El control del creixement per pRb està influenciat per diferents PTM, 5 amb l'activitat CDK com a nivell de control principal, la conducció de la fosforilació i la inactivació de l'activitat supressora del tumor pRb. En condicions d'estrès cel·lular, la fosforilació de pRb depenent del CDK és inhibida per la inducció de proteïnes inhibidores de CDK com p21, però també mitjançant la metilació directa de K810 en pRb per la metiltransferasa SET7 / 9. 8 El reclutament de la proteïna del domini tudor 53BP1 a K810 di-metilat es produeix posteriorment, la qual cosa permet l'activitat de pRb integrar-se amb la resposta de danys en l'ADN. 9

Aquí, hem descrit resultats sorprenents sobre un nou nivell de control de pRb, pel qual el K810 mono-metilat actua per reclutar el lector de metil PHF20L1 als promotors amb resposta a E2F, una interacció que hem trobat és important per al control de fase S (figura 6c) . És interessant que, a diferència del 53BP1 que és específic per a K810 di-metilat, 9 PHF20L1 s'uneix preferentment a la forma mono-metilada (Figures 1 i 2). Això indica que el grau de metilació K810 dicta el reclutament de proteïnes del lector, permetent modular i ajustar el control de creixement de pRb en ​​resposta a estímuls discrets. De fet, 53BP1 es recluta a pRb en ​​resposta a danys en l'ADN, 9 mentre que es va observar que el reclutament de PHF20L1 es va produir en cèl·lules no urbanitzades (Figura 2a).

Curiosament, s'ha descrit una situació anàloga per al supressor del tumor p53, que de manera similar es pot mono-metilar a K382 en cèl·lules no urbanitzades, però di-metilat al mateix lloc com a resposta a danys en l'ADN. 31, 32 p53K382me1 està involucrat en la repressió transcripcional mitjançant el reclutament de la proteïna que conté domini MBT L3MBTL1, 31 però p53K382me2 estabilitza els nivells de p53 durant la resposta de danys en l'ADN i recluta 53BP1. 32 SET7 / 9 és l'enzim responsable de generar RbK810me1 a les cèl·lules, 8 encara que és possible que altres metiltransferases puguin convertir aquesta marca a la forma di-metilada, anàloga a l'esdeveniment de metilació H4K20. A les cèl·lules, H4K20me1 està mediat per KMT5A, mentre que els enzims MMSET / WHSC1, KMT5B i KMT5C poden convertir la marca H4K20 en estats de metilació d'ordre superior. 33, 34, 35

Com que PHF20L1 s'ha identificat com a part del complex d'acetiltransferasa MOF, 17 també es va examinar si pRb i MOF podrien interactuar funcionalment (figura 3). Vam trobar una associació dependent de K810 entre pRb i MOF a les cèl·lules i vam comprovar que el reclutament de MOF a pRb metilat requeria la presència de PHF20L1 (Figures 3c i d). La MOF està íntimament relacionada amb la regulació transcripcional en cèl·lules de mamífers, 19, 20, 21, 22, 23, on està implicada en l’activació de gens implicats en l’autofagia i la progressió del cicle cel·lular. 19, 20 Tanmateix, és important tenir en compte que l’ablació de la MOF a les cèl·lules s’ha relacionat tant amb la regulació i la baixada de l’expressió gènica, 21, 22, cosa que suggereix que la MOF pot actuar com a regulador negatiu en alguns contextos. De fet, s'ha demostrat que H4K16ac recluta el complex de remodelació de la cromatina NoRC per silenciar una fracció de gens d'ARNN de mamífers, mitjançant l'establiment d'heterochromatina. 36, 37 Com que també se sap que pRb es relaciona amb factors de remodelació de la cromatina i metiltransferases implicades en l'establiment de l'heterochromatina, 38, 39, el reclutament de gens de PHF20L1-MOF a E2F també pot tenir un paper important en aquest aspecte del control transcripcional mediat per pRb. .

La interacció PHF20L1 / MOF amb pRb semblava ser particularment important durant la resposta cel·lular a la hidroxiurea, condició sota la qual es va observar que pRb tenia un impacte sobre la progressió del cicle cel·lular (Figura 6). 30 La pèrdua de PHF20L1 o pRb va causar una proporció més gran de cèl·lules en fase S després del tractament amb hidroxurea, mentre que el co-esgotament de pRb i PHF20L1 no va causar un efecte additiu en la distribució del cicle cel·lular. Això dóna suport a la hipòtesi que pRb i PHF20L1 / MOF medien els seus efectes a través d’una ruta compartida per regular el control de fase S adequat (figura 6c). Tot i això, no podem excloure la possibilitat que la pèrdua de PHF20L1 també pugui influir en l'estabilitat de la marca de metil K810, ja que la pèrdua de la proteïna del lector podria conduir a més metilació / desmetilació de K810. Atès que la metilació pRb promou la forma hipofosforilada de pRb, la pèrdua 8 de PHF20L1 podria influir en part en la distribució del cicle cel·lular mitjançant canvis a l’estat de la fosforilació de pRb, a més d’un reduït reclutament de MOF als gens objectiu E2F.

En conclusió, el nostre estudi descriu per primera vegada la interacció entre K810 mono-metilat de pRb i la seva proteïna lector PHF20L1. Els nostres resultats estableixen el paper del mon-metil K810 en connectar-se amb el control del punt de control de la fase S depenent de la pRb en ​​resposta a la hidroxiurea. Significativament, PHF20L1 recluta el complex d'acetiltransferasa MOF, destacant, al seu torn, una interacció inesperada entre el control de creixement de MOF, PHF20L1 i pRb. Els nostres resultats indiquen així l’important paper que tant el lloc com el tipus d’esdeveniment de metilació de la lisina poden tenir a l’hora de dictar les propietats biològiques del pRb.

Materials i mètodes

Plasmids i vectors d’expressió

pSG5-HA-pRb i pSG5-HA-pRb-K810R s'han descrit anteriorment. 8 p3xFlag-CMV-PHF20L1 es va generar mitjançant la clonació de la variant de transcripció PHF20L1 3 a partir de l'ADNc sintetitzat a partir de cèl·lules U2OS mitjançant primer i oligo-d (T) 16 i la transcriptasa inversa de Superscript III (Thermo Fisher; Waltham, MA, EUA). En la posterior reacció PCR es van utilitzar els imprimadors corresponents al principi d’ATG i l’aturada TGA de PHF20L1 i el producte resultant es va purificar en gel i es va lligar al vector p3xFLAG-CMV-7.1 (Sigma; St. Louis, MI, EUA). Y. Dou (Universitat de Michigan, EUA) va donar amablement els vectors d’expressió de mamífers i bacteris per a FLAG-MOF i GST-MOF. pGEX-PHF20L1 tudor 1 (1–74), pGEX-PHF20L1 tudor 2 (54–160), pGEX-PHF20L1 tudor 1 + 2 (1-150), pGEX-PHF20 tudor 1 (1–83), pGEX-PHF20 tudor 2 (58–148) i pGEX-PHF20 tudor 1 + 2 (1–148) van ser donats per MTB. pET28a-PHF20L1 tudor 1 i pNIC-Bsa4-PHF20L1 (longitud completa) es van generar subclonant la seqüència pertinent de PHF20L1 en un pET28a (Novagen, Merck; Darmstadt, Alemanya) o un vector pNIC-Bsa4 (donat per OF). PGEX-PHF20L1 tudor 1 D23A, p3xFlag-CMV-PHF20L1 D23A i p3xFLAG-CMV-PHF20L1 F47A es van generar tots els plànols amb l'ús d'un kit de mutagènesi dirigit per lloc (Stratagene; San Diego, CA, EUA).

Cultura i transfeccions de teixits

Les cèl·lules U2OS (ATCC núm. HTB-96), SAOS2 (ATCC núm. HTB-85) i MCF-7 (ATCC núm. HTB-22) (ATCC; Manassas, VA, EUA) es van cultivar en el medi Eagle modificat de Dulbecco (Sigma ), complementat amb un 10% (v / v) de FBS i penicilina / estreptomicina. Es van realitzar transfeccions durant 72 h mitjançant Genejuice (Novagen, Merck) segons les instruccions del fabricant. La interferència d’ARN es va realitzar mitjançant 20 nM de PHF20L1 (s27443), pRb (una combinació de dues seqüències de siRNA: siRbA - 5′-UGGUUCACCUCGAACACCC-3 ′, siRbB - 5′-UUCCUCCACACACUCCAGU-3 ′), MOF (5′AC-UAG) 3 ′) (tot Ambion, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) o GFP siRNA (Dharmacon; Lafayette, CO, EUA) durant 96 hores en oligofectamina (Invitrogen, Thermo Fisher, Waltham, MA, EUA) segons les instruccions del fabricant . Les línies de cèl·lules CRISPR de U2OS pRb es van generar mitjançant el mètode descrit per Ran et al. 40 línies de cèl·lules CRISPR p2b U2OS que expressen de forma estable pRb o pRb-K810R ectòpics es van generar transfectant les cèl·lules CRISPR amb 2 μ g pSG5-HA-pRb / pSG5-HA-pRb-K810R i 0, 2 μ g pcDNA3.1 (Thermo Fisher) a permetre la selecció en 150 μ g / ml G418 (Santa Cruz; Dallas, TX, EUA). Totes les existències de les línies cel·lulars es van provar de contaminació per micoplasma després de la seva generació i abans de l’emmagatzematge de nitrogen líquid.

Immunoblucció i immunoprecipitació

En els immunoblots es van utilitzar els anticossos següents: anti-pRb (4H1), anti-fosfo-pRb S807 / S811 (D20B12) (ambdues senyalitzacions cel·lulars; Danvers, MA, EUA), anti-GST (B-14), anti-GAPDH (V-18), anti-α-tubulina (TU-02), sonda anti-His (H-15) (tota Santa Cruz), anti-actina, anti-FLAG M2 (ambdós Sigma), anti-HA (Covance ; Princeton, NJ, EUA), anti-MOF (A300-992A) (Bethyl Laboratories; Montgomery, TX, EUA) i anti-PHF20L1 (HPA028417) (Sigma). Per a la immunoprecipitació, es van preparar extractes cel·lulars en tampó RIPA modificat (50 mM Tris pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630 (v / v), 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM AEBSF, barreja inhibidora de la proteasa) i incubat amb gel d'afinitat M2 anti-Flag o agarosa HA (ambdues Sigma) durant 2 h a 4 ° C. La resina es va rentar amb RIPA modificada i es va eluir amb tampó de càrrega 2x SDS.

Expressió de proteïnes

Els plasmids es van transformar en cèl·lules bacterianes BL21 (DE3) i es van cultivar colònies en un caldo excel·lent (Sigma) que conté antibiòtics adequats. L’expressió de proteïnes es va induir mitjançant l’addició d’1 mM IPTG durant 20 h a 20 ° C. A continuació, es van recollir els bacteris i es van purificar les proteïnes marcades amb GST o amb His com es va descriure anteriorment. 9

Cribratge de matrius CADOR

S'ha descrit la generació de microarrays proteïnes, 15 i s'ha publicat una llista dels dominis proteics de la matriu. Es van sintetitzar 25 pèptids com biotina-PEG-GNIYISPLKSPYKISEG i biotina-GNIYISPLK [me] SPYKISEG. Els pèptids biotinilats es van marcar com es descriu. 15

Interferometria bicapa

El BLI es va realitzar tal com es descriu, 9 amb els canvis següents: Les mostres His-PHF20L1 1 i les mostres His-PHF20L1 de longitud completa es van preparar en set dilucions de 2, 5 vegades a partir de 200 μ M i les mesures es van realitzar mitjançant un pas d'associació de 250 s seguit. per un pas de dissociació de 250 s en una placa de 384 pous negre.

Determinació de pèptids

Els pèptids es van sintetitzar i immobilitzar a la resina estreptavidina-agarosa (Thermo Fisher), tal com es va descriure anteriorment. 9 250 ng de GST recombinant i 250 ng de GST-PHF20L1 (tudor 1, tudor 2, o tudor 1 + 2) o GST-PHF20 (tudor 1, tudor 2 o tudor 1 + 2) van ser incubats amb els pèptids immobilitzats per 30 min a 4 ° C. Tot i que es va eliminar el flux i la resina es va rentar vuit vegades amb tampó RIPA modificat que contenia NaCl 300 mM. La proteïna lligada es va eluir mitjançant 80 μ l de tampon de càrrega 2 × SDS.

Assajos d’enllaç in vitro

Es van incubar 250 ng de GST-MOF recombinant i 250 ng de His-PHF20L1 amb 15 μ l de resina Ni-NTA (Qiagen; Hilden, Alemanya) en 500 μ l de tampó RIPA modificat (que conté 300 mM de NaCl) durant 30 min a 4 ° C. El flux de pas es va eliminar i la resina es va rentar vuit vegades en RIPA modificada (300 mM NaCl). La proteïna lligada es va eluir amb 80 μ l de tampon de càrrega SDS de 2x.

Immunoprecipitació amb cromatina

Les cèl·lules es van recollir i es van tornar a suspendre en PBS que contenien 1, 5 mM d’etilenglicol bis (succinatimidil succinat) (EGS; Sigma) durant 30 min a temperatura ambient. Després de la reticulación EGS, es va afegir formaldehid (1% v / v) durant 15 minuts més, abans de la neutralització amb glicina (0, 125 M). Les cèl·lules es van rentar en PBS i es van lisar primer en el tampó I (Tris 10 mM pH 8, NaCl 200 mM, 1 mM EDTA, 0, 5 mM EGTA, barreja inhibidora de la proteasa) durant 10 min, seguit de 10 min en el tampó II (10 mM Tris pH 8, 100 mM de NaCl, 1 mM EDTA, 0, 5 M EGTA, 0, 1% de Na-desoxicolat (p / v), 0, 5% de Na-lauroilsarcosina (v / v), barreja inhibidora de proteases). A continuació, es va sonar la cromatina abans de l'addició de l'1% de CA-630 Igepal (v / v). Els xip es van realitzar amb 3 μ g d’anticòs adequat (IgG control, anti-pRb [4H1], anti-PHF20L1 [HPA028417], anti-H4K16ac [39167] (Active Motif; Carlsbad, CA, EUA)) i proteïna pre-bloquejada. Unes perles. Dos rentats amb tampó de sal baixa (20 mM Tris pH 8, NaCl 150 mM, 2 mM EDTA, 0, 1% SDS (p / v), 1% Triton X-100 (v / v)), quatre rentats amb tampó de clorur de liti (10 mM Tris pH 8, 250 ml de LiCl 250 mM, 1 mM EDTA, 1% Igepal CA-630 (v / v), 1% de Na-desoxicolat (p / v)) i dos rentats amb tampó TE abans de l'elució es van realitzar 2 × 250 μ l SDS 1% (p / v), NaHCO 3 0, 1 M a 65 ° C durant 15 min. Es va afegir una concentració final de 200 mM NaCl, 10 mM EDTA i 40 mM Tris pH 6, 5 a cada eluït juntament amb RNAse A (20 μ g / ml) durant 3 h a 55 ° C. Els enllaços reticulats es van invertir durant la nit a 65 ° C abans d’un tractament amb proteïna K (200 μ g / ml) de 3 h a 55 ° C. Es purificà l’ADN i es realitzà una PCR en temps real amb Brilliant III Ultra-Fast SYBR en un instrument QPCR MX300P (Agilent; Santa Clara, CA, EUA). Es va investigar l'ocupació d'ADN en els promotors del gen TS, DHFR, CYCA i CDC25A amb resposta a E2F a partir de mostres triplicades. El 5% de la fracció total de cromatina emprada en la immunoprecipitació es va utilitzar per estandarditzar els senyals ChIP observats (ChIP / entrada) i els resultats es van expressar com a enriquiment de plecs sobre el control de IgG. En tots els casos, la figura presentada representa resultats combinats d’experiments de repetició biològics independents ( n com s’indica a les llegendes de la figura) i mostra un enriquiment mitjà amb PCR semicantitativa SE es va realitzar mitjançant l’ADN polimerasa Paq5000 (Agilent) i l’electroforesi en gel d’agarosa amb orientació per amor. els promotors indicats.

Anàlisi del cicle cel·lular

Les cèl·lules es van recollir amb tripsina i es van fixar en etanol al 70% en PBS durant la nit a 4 ° C. Les cèl·lules fixes es van tornar a suspendre en 40 μ g / ml de iòdur de propidi (Sigma) que contenia 200 μ g / ml RNAse A (Sigma) durant 1 h. L'anàlisi del cicle cel·lular es va realitzar mitjançant la mesura de la fluorescència al canal FL2 mitjançant un citòmetre de flux Accuri C6 i un paquet de programari de flux C6 (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ, EUA). Es van recollir un mínim de 2 × 10 4 esdeveniments a partir de mostres duplicades. Tret que s’indiqui el contrari, la figura presentada representa resultats combinats d’experiments de repetició biològics independents ( n com s’indica a les llegendes de la figura) i mostra el percentatge mitjà de cèl·lules de cada fase del cicle cel·lular, amb SE mostrat.

Tinció de BrdU

Les cèl·lules U2OS es van transfectar amb els siRNAs indicats i es van tractar amb hidroxurea d'1 mM durant les darreres 24 hores on s'indica. En els tractaments en què es va requerir l'alliberament de la detenció induïda per la hidroxiurea, es van rentar les cèl·lules quatre vegades en PBS i es van aplicar dues vegades un medi fresc. S'ha afegit bromodeoxiuridina (BrdU) de 10 μ M (Becton Dickinson) als medis durant 1 h abans de la tripsina i fixació en 70% d'etanol en PBS durant la nit a 4 ° C. Es van rentar i tractar les cèl·lules durant 30 min amb HCl 2 N, i després amb tetraborat de sodi 0, 1 M durant 10 min. Les cèl·lules es van bloquejar durant 30 min en bloqueig tampó (1% d’albúmina sèrica bovina (p / v), 0, 1% de Tritó X-100 (v / v), en PBS), després es van etiquetar amb 20 μ l d’anticòs anti-BrdU-FITC ( BD Pharmingen) en 100 μ l tampó de bloqueig durant 30 min. Es van realitzar tres rentats abans de tornar a gastar cèl·lules en iòdur de propidi / RNAse A buffer tal com es descriu per a l’anàlisi del cicle cel·lular. Es van recollir un mínim de 2 × 10 4 esdeveniments a partir de mostres duplicades. La figura mostrada és un experiment representatiu amb resultats expressats en percentatge mitjà de cèl·lules positives de BrdU, amb SE mostrat. El valor n citat a la figura llegenda representa el nombre d’experiments biològics independents de repetició realitzats.

Microscòpia de fluorescència

Les cèl·lules conreades sobre cobertures de 13 mm es van fixar en un 4% de paraformaldehid (p / v) en PBS durant 15 min, abans de la permeabilització en Tritó X-100 (v / v) al 0, 5% en PBS durant 15 min. A continuació, les cèl·lules es van bloquejar en bloqueig tampó durant 1 h, abans de l'etiquetatge d'1 h amb anticorp primari a la dilució 1: 500 (anti-HA (Y-11) (Santa Cruz) o anticorp anti-flag). Es van rentar les cèl·lules tres vegades abans de ser tacades amb anticossos secundaris durant 1 h (anticossos anti-ratolí i anti-conill Alexa Fluor 488 i 594 (Thermo Fisher)). Es van rentar tres vegades més les cèl·lules i es van muntar en diapositives de vidre mitjançant els suports de muntatge que contenen DAPI (Vectorlabs; Peterborough, Regne Unit). Les imatges es van recollir mitjançant el programari Openlab5 (Improvision; Coventry, Regne Unit) i un microscopi fluorescent Olympus BX60 equipat amb una càmera de càmera Hamamatsu C4742-95.

Anàlisis estadístiques

Les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant un test de dos estudiants, que no es compara amb el programari Excel (Microsoft; Redmond, WA, EUA). Tret que s'indiqui el contrari, les dades es mostren com a mitjans amb SE mostrat. Els valors P s’indiquen com a ** P <0, 02 o * P <0, 05.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

    La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la diferenciació de la cel·lular (//www.nature.com/cdd)