Tweak afavoreix la calcificació induïda per fosfat de cèl·lules musculars llises vasculars mitjançant l'activació canònica i no canònica de nfκb | mort i malaltia cel·lular

Tweak afavoreix la calcificació induïda per fosfat de cèl·lules musculars llises vasculars mitjançant l'activació canònica i no canònica de nfκb | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Calcificació
  • Senyalització cel·lular
  • NF-kappaB

Resum

La calcificació vascular (VC) està associada a l’augment de la mortalitat cardiovascular en l’envelliment, la malaltia renal crònica (CKD), la diabetis mellitus tipus 2 (T2DM) i l’aterosclerosi. El dèbil inductor d'apoptosi, com el TNF, va aparèixer recentment com a nou biomarcador per al diagnòstic i el pronòstic de malalties cardiovasculars. Es va informar que TWEAK que es va unir al seu receptor funcional Fn14 va promoure diversos passos de progressió de la placa ateroscleròtica. Tanmateix, actualment no hi ha informació sobre el paper de TWEAK / Fn14 en el desenvolupament de la calcificació medial, molt prevalent en l’envelliment, la CKD i la T2DM. Aquest estudi va explorar la implicació de TWEAK en la calcificació de cèl·lules musculars llises vasculars humanes (h-VSMCs) in vitro . Informem que TWEAK que s’uneix a Fn14 promou la calcificació h-VSMC induïda per fosfat inorgànica, afavoreix la transició osteogènica h-VSMC, disminueix l’acta2 i el myh11 i augmenta l’ARNm de bmp2 i el teixit fosfatasa alcalina no específica (TNAP) i augmenta l’activitat MMP9. El bloqueig de la via canònica de NF κ B es va reduir en un 80% les propietats pro-calciques TWEAK i va disminuir l’activitat osteogènica, l’activitat TNAP i MMP9. El bloqueig de la senyalització no canònica de NF κ B mitjançant un SiRNA dirigit a RelB va reduir en un 20% els efectes pro-calpecífics de TWEAK i va disminuir la pèrdua induïda per TWEAK de fenotip contràctil h-VSMCs i l'activitat de MMP9, sense modular l'activitat del mmp ARP o TNAP. La inhibició de l’activació d’ERK1 / 2 per un inhibidor de la kinasa MAPK no va influir en les propietats pro-calciques de TWEAK. Els nostres resultats suggereixen que TWEAK / Fn14 afavoreix directament la calcificació inorgànica induïda amb fosfat h-VSMCs mitjançant l'activació de vies canòniques i no canòniques de NF κ B. Tenint en compte la disponibilitat de les estratègies de neutralització anti-TWEAK, el nostre estudi fa llum sobre l'eix TWEAK / Fn14 com a objectiu terapèutic nou en la prevenció de la VC.

Principal

La calcificació vascular (VC) es caracteritza per l’acumulació de sals de calci i fosfat dins del sistema cardiovascular. El VC es pot desenvolupar a l’intima i als mitjans dels vasos, així com en les vàlvules cardíaques i està associat a un augment de la mortalitat cardiovascular. El 1 VC resulta d’un desequilibri entre inductors de calcificació (per exemple, trastorns minerals, inflamació) i inhibidors (per exemple, Fetuina A, proteïna Gla Matrix, pirofosfat (PPi)). Un augment dels nivells de fosfat inorgànic (Pi) o Ca 2+, la inflamació o lesions vasculars condueixen a la conversió osteo-condrogènica de cèl·lules musculars llises vasculars (VSMCs), fibroblasts residents o cèl·lules intersticials de vàlvules quiescents, que recentment expressen el factor de transcripció relacionat amb el runt. fosfatasa alcalina no específica de teixit (TNAP) i proteïna morfogenètica òssia 2 (BMP2). Això està associat a l’alliberament de vesícules matricials pro-calciques i a la remodelació de la matriu extracel·lular (síntesi de col·lagen tipus I i degradació de l’elastina). A més, aquest entorn precalcific afavoreix l’apoptosi de cèl·lules vasculars i l’alliberament de cossos apoptòtics, que són capaços de nuclear la hidroxiapatita. 3

El VC preval molt en l’envelliment, la malaltia renal crònica (CKD), la diabetis mellitus tipus 2 (T2DM) i l’aterosclerosi. L’envelliment 4 i el CKD 5 s’associen a una inflamació sistèmica crònica de baix grau i la inflamació agreuja malalties relacionades amb l’edat, com l’aterosclerosi i la T2DM. 6 estudis recents van proporcionar evidències convincents que la VC està associada a la inflamació i que es veu reforçada per algunes citoquines inflamatòries. Tanmateix, les citocines precises i, per tant, quins podrien ser els objectius terapèutics, no s’han caracteritzat adequadament. En particular, alguns membres de la superfamília TNF promouen la transició osteogènica VSMC induïda per Pi i la posterior calcificació. 7 debilitat inductor d'apoptosi, com el TNF (TWEAK), és una citocina superfamílica TNF que ha aparegut recentment com a nou biomarcador de diagnòstic i pronòstic de malalties cardiovasculars. 8 TWEAK unit a membrana pot ser processat per furin en TWEAK soluble (sTWEAK). 9 TWEAK que s'uneix a la molècula inductible del factor de creixement del fibroblast receptor 14 (Fn14) activa la senyalització de la proteïna quinasa activada amb mitogen (MAPK) i promou l'activació de NF κ B per vies canòniques i no canòniques. Com a conseqüència, TWEAK regula la proliferació, migració, diferenciació, defunció, mort, inflamació, fibrosi i angiogènesi de tipus cel·lular i de tipus microambiental. 10, 11, 12, 13

TWEAK s’expressa mitjançant parets arterials normals i patològiques. 14 Tot i que TWEAK es pot regularitzar després de lesions, els canvis en la seva expressió gènica solen ser moderats. Per contra, l’expressió de Fn14 a la vasculatura sana sol ser baixa o indetectable. Tot i això, es regula ràpidament i altament en condicions patològiques, tal com es descriu en els aneurismes aòrtics i les plaques ateroscleròtiques caròtides, sensibilitzant als efectes de TWEAK. 14, 16 Les dades de models animals indiquen que TWEAK / Fn14 contribueix a la formació d'aneurisme aòrtic abdominal. 17 A més, l’eix TWEAK / Fn14 promou diversos passos de desenvolupament de plaques ateroscleròtiques, incloent iniciació, progressió, desestabilització / ruptura i posterior trombosi. En particular, en els ratolins ApoE KO, el tractament anti-TWEAK va disminuir la inflamació associada a la progressió de la placa ateroscleròtica, incloent el pas final de la calcificació de la placa. 18

Tot i que aquestes dades suggereixen un paper per a l’eix TWEAK / Fn14 en la fisiopatologia de la calcificació íntima en l’aterosclerosi, no està clar si la disminució de la calcificació de placa ateroscleròtica en ratolins tractats anti-TWEAK és el resultat d’una menor càrrega ateroscleròtica o d’un efecte directe de TWEAK sobre la calcificació íntima. A més, actualment no hi ha informació sobre el paper de TWEAK / Fn14 en la calcificació medial, tal com s’observa en CKD i altres condicions. El present estudi tenia com a objectiu avaluar el potencial de TWEAK per promoure directament la calcificació de VSMCs humans (h-VSMCs) in vitro.

Resultats

L'eix TWEAK / Fn14 afavoreix la calcificació induïda per Pi i la transició osteogénica h-VSMC

Per explorar la capacitat de TWEAK de modular la mineralització h-VSMCs, les cèl·lules es van incubar durant 7 dies en condicions pro-calciques (3 mmol / l Pi) en combinació amb concentracions creixents de TWEAK (1-200 ng / ml). En presència de 3 mmol / l de Pi, TWEAK va augmentar significativament la deposició de minerals de manera dependent de la concentració, tal com es va determinar amb la tinció vermella d'Alizarin (Figura 1a). TWEAK no va mostrar cap efecte en la calcificació de h-VSMCs quan no es va afegir Pi als mitjans de cultiu (figura suplementària S1). Experiments posteriors van utilitzar 100 ng / ml TWEAK, ja que era la concentració més baixa de TWEAK, afavorint significativament la calcificació induïda per Pi, tot i que es va observar una tendència d’1 ng / ml. La viabilitat i la proliferació dels h-VSMC no van ser afectats per Pi ni per TWEAK (figura suplementària S2). La baixada de Fn14 per un siRNA (figura suplementària S3A) va abolir els efectes de TWEAK en la calcificació induïda per Pi en comparació amb les cèl·lules transfectades revoltes (figura 1b).

Image

TWEAK / Fn14 promou la calcificació h-VSMCs induïda per Pi mitjançant l’activació de Fn14. ( a ) Efecte de TWEAK sobre la deposició de minerals induïda pel Pi (tinció vermella Alizarin). h-VSMCss es van cultivar durant 7 dies en condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi) en presència o absència de TWEAK (1-200 ng / ml) en un medi que contenia 1% de FBS. Barres d’escala: 500 μ m. * P <0, 05 i ** P <0, 01 contra cèl·lules exposades a 3, 0 mmol / l Pi sense TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM ( b ) L’impacte de la regulació descendent de Fn14 en la calcificació induïda per TWEAK h-VSMCs en condicions pro-calciques (tinció vermella d’Alizarin). Barres d’escala: 500 μ m. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

Per entendre com l'activació de l'eix TWEAK / Fn14 va promoure la mineralització h-VSMC induïda per Pi in vitro , es va valorar la influència de TWEAK en la transició osteogènica h-VSMCs, l'activitat TNAP i la metaloproteinasa matricial (MMP) tant en formes no calciques (1.1 mmol / l Pi) i condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi). Les dades obtingudes per qRT-PCR van demostrar que una exposició de 7 dies a 100 ng / ml TWEAK va reduir al voltant d’un 70% l’expressió dels marcadors contràctils acta2 i myh11 en condicions no calciques (figures 2a i b) i va amplificar significativament uns tres. -doble disminució dels dos marcadors en un entorn pro-calcificat (Pi 2a i b). Pel que fa a la conversió osteogènica de h-VSMCs, TWEAK va augmentar en un 60% l'expressió d'ARNm bmp2 en condicions no calciques i va desencadenar un augment del triple de nivell d'RNAm de bmp2 en condicions pro-calciques (Figura 2c). TNAP hidrolitza PPi, un fort inhibidor de la deposició de fosfat de calci i, per tant, afavoreix la calcificació. 19 En condicions no i pro-calcícoles, 7 dies de TWEAK van augmentar un 25% l’expressió TNAP (figura suplementària S4), cosa que va suposar un augment del 40 i el 120% de l’activitat del TNAP, respectivament (figura 2d). A la vasculatura, MMP2 i MMP9 acceleren la degradació de l’elastina i afavoreixen la calcificació. En el nostre model, TWEAK no va modular l'expressió d'ARNm MMP2 (Figura 3a) ni la seva activitat (Figura 3c), sinó que va augmentar significativament tant l'expressió d'ARNm MMP9 (Figura 3b) com l'activitat (Figura 3c) en condicions no i pro-calciques.

Image

TWEAK / Fn14 promou la transició osteogénica h-VSMC. Es van avaluar els efectes de TWEAK (100 ng / ml, 7 dies) tant en condicions no calciques (Ct: 1, 1 mmol / l Pi) com pro-calciques (Pi: 3, 0 mmol / l Pi). ( a - c ) Efectes de TWEAK en l'expressió d'ARNm acta2 ( a ), myh11 ( b ) i bmp2 ( c ) ARNm, avaluats mitjançant transcriptasa inversa quantitativa-PCR. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001 vs cèl·lules exposades a 1, 1 mmol / l Pi sense TWEAK. $ P <0, 05, $$ P <0, 01, $$$ P <0, 001 enfront de cèl·lules exposades a 3, 0 mmol / l Pi sense TWEAK. P <0, 05, †♥♥ P <0, 001 vs cèl·lules exposades a 1, 1 mmol / l Pi amb TWEAK. Els resultats representen almenys tres experiments independents realitzats per triple. Les barres d’error representen els efectes del SEM ( d ) Efectes de TWEAK sobre l’activitat TNAP avaluada pel test de fosfatasa PNPP. * P <0, 05, ** P <0, 01 contra cèl·lules exposades a 1, 1 mmol / l Pi sense TWEAK. $ P <0, 05 vs cèl·lules exposades a 3, 0 mmol / l Pi sense TWEAK. † P <0, 05 vs cèl·lules exposades a 1, 1 mmol / l Pi amb TWEAK. Els resultats representen cinc experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM

Imatge a mida completa

Image

TWEAK / Fn14 promou l’activitat MMP9 però no l’activitat MMP2. ( a i b ) Efectes de TWEAK sobre mmp2 ( a ) i mmp9 ( b ) expressió de mRNA avaluats mitjançant quantitativa transcriptasa inversa-PCR. ** P <0, 01 contra cèl·lules exposades a 1, 1 mM Pi sense TWEAK. $$$ P <0, 001 vs cèl·lules exposades a 3, 0 mmol / l Pi sense TWEAK. Els resultats representen almenys tres experiments independents realitzats per triple. Les barres d’error representen els efectes SEM ( c ) Efectes de TWEAK sobre l’activitat MMP2 i MMP9 en els sobrenadants h-VSMCs, avaluats per zimografia en gel. ** P <0, 01, *** P <0, 001 vs cèl·lules exposades a 1, 1 mM Pi sense TWEAK. $$$ P <0, 001 vs cèl·lules exposades a 3, 0 mmol / l Pi sense TWEAK. †Search P <0, 01 contra cèl·lules exposades a 1, 1 mmol / l Pi amb TWEAK. Els resultats representen almenys tres experiments independents realitzats per triple. Les barres d’error representen el SEM NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

A les cèl·lules tubulars renals, els macròfags i el teixit renal, el compromís ERK i l'activació canònica i no canònica de NF κ B contribueixen als efectes inflamatoris de TWEAK. 10, 12, 20, 21 Per identificar les vies intracel·lulars responsables dels efectes pro-calcificats de TWEAK / Fn14, la senyalització de TWEAK es va bloquejar mitjançant inhibidors de molècules petites o siRNA. Com que l’apoptosi és un inductor clau de la calcificació de h-VSMCs, ens vam assegurar que les concentracions d’inhibidors usades per bloquejar la calcificació induïda per TWEAK h-VSMCs no van modular la viabilitat cel·lular durant els 7 dies de tractament (figura suplementària S5A).

L’activació MAPK induïda per TWEAK / Fn14 no està implicada en efectes pro-calcificats de TWEAK

En h-VSMCss, TWEAK afavoreix la fosforilació ERK de manera dependent del temps, amb un pic després d’estimulació després de 10 min (figura suplementària S6A). La transfecció amb SiRNA de Fn14 va abolir totalment la fosforilació ERK induïda per TWEAK en comparació amb cèl·lules transfectades revoltes (figura suplementària S6B). L’exposició crònica a 10 μ mol / l U0126, un inhibidor selectiu de les MAPK kinases MEK1 i MEK2, va inhibir la fosforilació ERK induïda per TWEAK (figura suplementària S6C) però no va modular els efectes pro-calcificats de TWEAK en la mineralització h-VSMC induïda per Pi. amb h-VSMC no exposat a U0126 (figura suplementària S6D).

L’activació de NF on B canònica induïda per TWEAK / Fn14 afavoreix la calcificació h-VSMC induïda per Pi promovent la transició osteogènica, l’activitat TNAP i l’activitat MMP9

La fosforilació i posterior degradació proteasomal de I κ B és un distintiu de l’activació de la via NF κ B clàssica que facilita l’alliberament de dímers p65 (RelA) / p50, que després migren al nucli per modular l’expressió gènica proinflamatòria. La fosforilació addicional de RelA en Ser536 és essencial per a la transactivació gènica. En h-VSMCss, TWEAK va induir la translocació nuclear RelA i la posterior fosforilació de forma dependent del temps, assolint un pic de 10 min (figures suplementàries S7A i C). Els experiments amb pèrdues de funcions amb siRNA contra Fn14 van abolir la translocació nuclear RelA induïda per TWEAK i la fosforilació posterior en comparació amb cèl·lules transfectades revoltes (Figs Suplementàries S7B i D). La transfecció amb un siRNA contra RelA, que va reduir en un 75% l'expressió RelA en h-VSMCss (figura suplementària S8A) i va abolir la fosforilació RelA (figura suplementària S8B), va disminuir significativament en un 80% el TWEAK amb una ampliació de calcificació induïda per Pi en comparació amb un transfectat revolt. cèl·lules (Figura 4a). En condicions pro-calcifiques, el SiRNA de RelA va prevenir un 60 i un 50%, respectivament, la disminució de l'expressió d'ARNm d'acta2 i myh11 induïda per TWEAK (figures 4b i c). D’interès, l’orientació de RelA va abolir completament l’augment induït per TWEAK en l’expressió de bmp2 ARNm (figura 4d), l’activitat TNAP (figura 5a) i l’expressió d’ARNm MMP9 (figura 5b) i l’activitat (figura 5c) en comparació amb cèl·lules transfectades revoltes.

Image

L’activació de NF on B canònica induïda per TWEAK / Fn14 afavoreix la calcificació h-VSMC induïda per Pi promovent la transició osteogènica. Els h-VSMCss van ser transfectats amb siRNA ratllat o RelA i exposats o no durant 7 dies a TWEAK en condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi). ( a ) Impacte de la regulació descendent de RelA en la calcificació h-VSMC induïda per TWEAK / Fn14 en condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi). La mineralització es va mesurar mitjançant tinció vermella d'Alizarin. Barres d’escala: 500μm. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. $ P <0, 05 vs Cèl·lules transfectades de SiRNA RelA sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen l’impacte de la regulació de baixada de RelA SEM ( b - d ) sobre la modulació induïda per TWEAK d’acta2 ( b ), myh11 ( c ) i l’expressió de mRNA de bmp2 ( d ), avaluada per transcriptasa inversa quantitativa-PCR. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. $ P <0, 05 vs Cèl·lules transfectades de SiRNA RelA sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

Image

L’activació de NF κ B canònica induïda per TWEAK / Fn14 afavoreix l’activitat TNAP i MMP9. Els h-VSMCss van ser transfectats amb siRNA ratllat o RelA i exposats o no durant 7 dies a TWEAK en condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi). ( a ) Impacte de la baixada de RelA en la modulació de TWEAK de l'activitat del TNAP. L’activitat del TNAP es va avaluar mitjançant el test de la fosfatasa pNPP. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Les barres d'error representen el SEM ( b ) L'impacte de la regulació de RelA en l'expressió d'ARNm mmp9 induïda per TWEAK per valoració de la transcriptasa inversa-PCR quantitativa. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM ( c ) L’impacte de la regulació de RelA en l’activitat MMP9 induïda per TWEAK, avaluada per zimografia en gel sobre el sobrenedant cel·lular. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

L’activació no canònica de NF κ B induïda per TWEAK / Fn14 promou la pèrdua de h-VSMCs del fenotip contràctil, així com l’activitat de MMP9, però no modifica ni l’expressió bmp2 ni l’activitat TNAP.

L’activació de la via no canònica NF κ B es caracteritza per processar NF κ B2 p100 a NF κ B p52. Això es tradueix en la formació d’heterodímetres p52 / RelB amb activitat reguladora transcripcional. A h-VSMCss, TWEAK va disminuir p100 i va augmentar p52 de forma dependent del temps (figura suplementària S9A). Tanmateix, com en altres tipus de cèl·lules, el TNF- α no va activar la via no canònica de NF κ B (figura suplementària S10). 20 experiments amb pèrdues de funció amb siRNA contra Fn14 van abolir el processament p100 induït per TWEAK en comparació amb cèl·lules transfectades revoltes (figura suplementària S9B). La transfecció amb un relB de targetització siRNA, que va reduir en un 80% l’expressió RelB (figura suplementària S11A) i va bloquejar l’expressió induïda per TWEAK del gen no canònic NF κ B CCL21 (figura suplementària S11B), va disminuir un 20% els efectes de TWEAK en la calcificació induïda per Pi en comparació amb cèl·lules transfectades revoltes (figura 6a). En condicions pro-calcícoles, la regulació de baixada de RelB va impedir el 50 i el 25%, respectivament, la descrelació induïda per TWEAK de l'expressió d'ARNm de acta2 i myh11 (figures 6b i c), però no va modular l'aforament d'ARNm bmp2 induït per TWEAK (figura 6d) ni l'activitat de TNAP. (Figura 7a). D’interès, l’orientació a RelB va reduir significativament l’expressió d’ARNm MMP9 induïda per TWEAK (figura 7b) i va disminuir l’activitat de MMP9 (figura 7c).

Image

L’activació no canònica de NF κ B induïda per TWEAK / Fn14 promou la pèrdua de fenotip contràctil per als h-VSMC, però no modula l’expressió de bmp2. Els h-VSMCss van ser transfectats amb siRNA ratllat o RelB i exposats o no durant 7 dies a TWEAK en condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi). ( a ) Impacte de la regulació descendent de RelB en la calcificació de h-VSMC induïda per TWEAK / Fn14. La mineralització es va mesurar mitjançant tinció vermella d'Alizarin. Barres d’escala: 500 μ m. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. $ P <0, 05 vs cèl·lules transfectades amb siRNA RelA i no exposades a TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen l’impacte de la regulació de baixada de RelB en la modulació induïda per TWEAK d’acta2 ( b ), myh11 ( c ) i l’expressió de mRNA de bmp2 ( d ), valorada per transcriptasa inversa quantitativa-PCR. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. $ P <0, 05 vs siRNA RelB transfectades cèl·lules sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

Image

L'activació no canònica de NF κ B induïda per TWEAK / Fn14 no influeix en l'activitat del TNAP, però afavoreix l'activitat mmp9. Els h-VSMCss van ser transfectats amb siRNA ratllat o RelB i exposats o no durant 7 dies a TWEAK en condicions pro-calciques (3, 0 mmol / l Pi). ( a ) Impacte de la regulació de baixada de RelB sobre la modulació de l'activitat del TNAP induïda per TWEAK. L’activitat del TNAP es va avaluar mitjançant el test de la fosfatasa pNPP. ** P <0, 01 contra cèl·lules transfectades revoltes sense TWEAK. $$ P <0, 05 vs cèl·lules transfectades amb siRNA RelB i no exposades a TWEAK. Les barres d’error representen el SEM ( b ) L’impacte de la regulació descendent de RelB sobre l’expressió d’ARNm mmp9 induïda per TWEAK per valor de la transcriptasa inversa-PCR quantitativa. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. $ P <0, 05 vs siRNA RelB transfectades cèl·lules sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM ( c ) L’impacte de la regulació de RelB en l’activitat MMP9 induïda per TWEAK avaluada per la zimografia en gel en els sobrenadants de h-VSMCs. * P <0, 05 vs cèl·lules transfectades remuntades sense TWEAK. P <0, 05 vs cèl·lules transfectades revoltes exposades a TWEAK. Els resultats representen tres experiments independents realitzats per triplicat. Les barres d’error representen el SEM NS, poc significatiu

Imatge a mida completa

TWEAK regula la expressió Fn14 en h-VSMCss

Tot i que Fn14 està regulat in vivo en situacions d’estrès cel·lular o tissular, els mecanismes són poc entesos. L’expressió Fn14 es va regularitzar després de 7 dies d’exposició a TWEAK tant en condicions no calícoles com pro-calciques (figura suplementària S12A). L’activació canònica, però no no canònica, de NF κ B va estar implicada en la regulació d’expressions de Fn14 en resposta a TWEAK (figura suplementària S12B).

Discussió

La conclusió principal és que la citocina inflamatòria TWEAK promou directament la calcificació de h-VSMCs mitjançant la implicació de Fn14 tant de senyalització canònica com de canonical NF κ B. La inflamació sistèmica crònica de baix nivell és freqüent en l’envelliment, T2DM i CKD i s’associa amb augment de la prevalença, la gravetat i la progressió del VC i augment de la mortalitat. 22, 23, 24 TWEAK promou lesions cardiovasculars i renals en models animals experimentals. S'han associat 25, 26, 27 nivells reduïts de circulació sTWEAK amb malalties de l'artèria coronària, 28 insuficiència cardíaca sistòlica, 29 malaltia de l'artèria perifèrica 30 i aneurisma abdominal aòrtic 16 i predir la gravetat de l'aterosclerosi. La reducció de 31 sTWEAK està associada a una regulació ràpida i alta del receptor funcional TWEAK Fn14, 14, 16, que es creu que amplifica l'acció local de sTWEAK dins dels teixits cardiovasculars. Les concentracions circulants de sTWEAK disminueixen en la malaltia renal en fase final i la T2DM. Tanmateix, els nivells de sTWEAK es troben més elevats en subjectes d’hemodiàlisi amb calcificació severa que en aquells amb calcificació no greu 33 i nivells de TWEAK més alts s’associen a un risc més alt de mortalitat causal i cardiovascular, 34 suggerint un vincle entre sTWEAK i VC.

Tot i que el paper de TWEAK en l'aterosclerosi s'ha caracteritzat àmpliament, no hi ha informació sobre el paper de TWEAK en la calcificació medial, un signe distintiu de CKD i T2DM. El nostre estudi va demostrar que TWEAK afavoreix directament la calcificació in-vitro h-VSMC induïda per Pi i recolza un paper de TWEAK en VC més enllà d’afavorir l’aterosclerosi. TWEAK va ampliar la pèrdua de marcadors contràctils induïda per Pi i l'adquisició de marcadors osteogènics, cosa que suggereix que TWEAK augmenta la calcificació in vitro afavorint la transició osteogénica h-VSMC induïda per Pi. A més, TWEAK va augmentar l'expressió i l'activitat del TNAP tant en condicions no precícoles com en altres. TNAP hidrolitza PPi, un inhibidor del VC, i genera Pi, fonamental per a la formació d’hidroxiapatita. En degradar PPi, TNAP promou la calcificació, canviant la relació Pi / PPi cap a la mineralització. 35 D'interès, al contrari del TNF- α , 36 TWEAK no van induir la calcificació de h-VSMCs en absència de medi fosfat alt (figura suplementària S1) tot i que va induir una transició osteogènica, activitat TNAP i MMP9 en condicions no calciques.

Es coneix que molts agents pro-calcifics promouen la mineralització dels h-VSMCs mitjançant la secreció d'una matriu pro-calcique rica en col·lagen de tipus I. En models animals, TWEAK afavoreix la fibrosi. 13, 37 En el present treball, una exposició de 7 dies a TWEAK va reduir significativament l’expressió de col·lagen de tipus I tant a nivell d’ARNm com a proteïna (figura suplementària S13), cosa que suggereix que els efectes pro-calcificats de TWEAK no depenen de la secreció d’un pro -matriu calcària. Aquestes dades s’ajusten a un informe recent del nostre grup que mostrava una disminució de l’expressió de col·lagen de tipus I en fibroblasts cultivats in vitro en presència de TWEAK. 13 En aquest treball, els autors van demostrar que els efectes pro-fibròtics de TWEAK observats in vivo resulten de la proliferació de fibroblast induïda per TWEAK en lloc de la síntesi de col·lagen.

TWEAK que s’uneix a Fn14 desencadena el reclutament de TRAF2 i TRAF5, activant així vies de senyalització, com ara MAPKs i NF κ B. 38, 39 MAPK i NF κ B senyalització s’havien implicat en la calcificació VSMC induïda per TNF- α en un medi amb fosfat alt. 40, 41 En el present treball, TWEAK enllaçar a la Fn14 va induir la senyalització MAPK mitjançant la fosforilació ERK. Tanmateix, la inhibició de la fosforilació ERK1 / 2 no va influir en els efectes pro-calcificats de TWEAK, subratllant les diferències en els mecanismes pels quals TNF- α i TWEAK afavoreixen la calcificació de VSMC. TWEAK activa en diverses senyalitzacions canòniques de NF κ B, una resposta de curta durada que resulta en migració nuclear de complexos que contenen p65 (RelA) i una via no canònica de durada més llarga que produeix migració nuclear de NF κ B2 p52 / RelB -complexes complexes. 20, 39, 42 En el nostre model, l’activació de Fn14 per part de TWEAK implicava vies canonicals i no canòniques NF κ B. El bloqueig de l'activació canònica de NFκB per siRNA va disminuir significativament la transició osteogènica h-VSMC induïda per TWEAK i l'activitat TNAP, que va reduir en un 80% els seus efectes pro-calcifics. Aquests efectes són similars als del TNF- α , que van promoure la transició osteogènica VSMC i l’activitat TNAP mitjançant l’activació canònica de NF κ B. 43, 44, 45, 46 El bloqueig de la via no canònica de NFκB per un siRNA va disminuir significativament la pèrdua de fenotip contràctil h-VSMC induïda per TWEAK, però no va influir en l'expressió bmp2 induïda per TWEAK ni en l'activitat TNAP i va reduir en un 20% TWEAK pro-calcific efectes. En aquest sentit, les accions de TWEAK difereixen de les de TNF- α , com en el nostre model, com en altres tipus cel·lulars, TNF- α no activa la via no canònica NF κ B (figura suplementària S10). A més, en el nostre model, la calcificació induïda per Pi o la magnificació de calcificació TWEAK no depenien de l’apoptosi h-VSMCs. Per contra, es va informar que TNF- α va afavorir l'apoptosi de VSMC induïda per Pi i la posterior calcificació. 47 En aquest sentit, el receptor Fn14 manca del domini de la mort característic de la superfamília del receptor TNF. Així, els mecanismes moleculars de l'apoptosi induïda per TWEAK semblen diferir dels de TNF- α .

La degradació de l’elastina vascular augmenta l’afinitat extracel·lular de la matriu pel calci, 48 facilitant el creixement epitàctic d’hidroxiapatita al llarg de les làmines elàstiques. Els ratolins MMP2 i MMP9 tenen un paper crucial ja que els ratolins MMP-2 - / - i MMP-9 - / - eren resistents a la degradació i calcificació d'elastina. 49 Citocines proinflamatòries, com TNF- α 50 i IL-1 β , 51 són forts inductors de l'activitat de MMP al sistema cardiovascular. En el present treball, l’exposició a llarg termini a TWEAK va afavorir l’expressió i l’activitat de MMP9 però no de MMP2. Aquests resultats estan d’acord amb un informe recent que mostra una major interrupció de la capa elàstica i augment de l’activitat MMP en els aortes dels ratolins WT que en els dels ratolins TWEAK - / - o Fn14 - / - . En el nostre model, h-VSMCss es van cultivar en un sistema 2D sense elastina, per la qual cosa els efectes pro-calcifics de TWEAK observats in vitro poden no ser conseqüència directa d’un augment d’activitat de MMP9. Tot i això, aquestes dades suggereixen que el sTWEAK in vivo pot augmentar l’activitat vascular de MMP9 i així iniciar VC en condicions normals de fosfat o empitjorar el VC desencadenat per la hiperfosfatèmia, tal com s’observa en CKD.

En teixits sans, l’expressió Fn14 sol ser baixa o no detectable, tot i que es regula ràpidament i altament en condicions patològiques, com l’infart de miocardi, la 52 restenosi després d’una lesió de globus 53 o l’aterosclerosi. 14 A les cèl·lules de les parets vasculars lesionades, 14, 53, 54 Fn14 està regulada per citocines, com TNF- α , IL1- β i IFN- γ . En el present estudi, l'expressió Fn14 va ser regulada per TWEAK tant en condicions no californianes com pro-calciques, cosa que podria amplificar propietats pro-calciques de TWEAK. Poc se sap sobre la regulació de l'expressió Fn14, i només la via RhoA / ROCK s'ha relacionat amb la regulació Fn14 en cardiomiocits i h-VSMCs. 14, 55 Per primera vegada, segons sabem, informem que l'activació canònica, però no no canònica, de NF κ B promou l'expressió Fn14 en h-VSMCss exposada a TWEAK.

Un informe anterior del nostre equip va demostrar que TWEAK s’expressa tant en macròfags com en cèl·lules musculars llises dins de les plaques ateroscleròtiques caròtides. 14 Confirmant aquestes dades, en el nostre model TWEAK s’expressa de manera constitutiva per h-VSMCss primari (figura suplementària S14A). No obstant això, no va ser modulat durant el procés de mineralització ni per Pi ni per la pròpia TWEAK (figura suplementària S14B), cosa que suggereix que en el nostre model TWEAK els efectes pro-calcificats no estan relacionats amb l’augment de la secreció autocrina de TWEAK en h-VSMCss.

A més, l'activació de NF κ B induïda per TWEAK regula els in vivo diverses citocines implicades en el reclutament de cèl·lules inflamatòries a les parets del vas lesionat, com ara MCP-1 i RANTES, 56 que podrien magnificar els efectes pro-calcifics directes. A més, en monòcits de cultiu, TWEAK augmenta HMGB1, 21 que uneix tant RAGE com TLR4 per mediar localment la calcificació VSMC induïda per la glucosa. 57 Es pot considerar, doncs, una contribució in vivo de HMGB1 induïda per TWEAK a VC relacionada amb T2DM. Finalment, TWEAK regula les expressions de Klotho renal i els ratolins deficients de Klotho presenten VC. 58

En conclusió, l'activació canònica de NF κ B induïda per TWEAK / Fn14 afavoreix directament la transició osteogènica induïda per Pi i l'activitat TNAP, promovent la calcificació h-VSMCs induïda per Pi. La pèrdua de marcadors contractils de h-VSMC com a conseqüència de l'activació no canònica de NF F B induïda per TWEAK / Fn14 amplifica aquest fenomen (Figura 8). Segons el nostre coneixement, aquest és el primer informe sobre un efecte pro-calcific directe de TWEAK i de la implicació no canònica de la via NF κ B sobre la calcificació medial. A més, la regulació de TWEAK de l'activitat de MMP i la secreció pro-inflamatòria de citocines, juntament amb les seves propietats pro-arogèniques converteixen TWEAK en un potent inductor de calcificació tant íntima com medial. Atesa la disponibilitat de la neutralització d’estratègies anti-TWEAK, aquest treball fa llum a TWEAK com a possible objectiu terapèutic innovador per prevenir el VC. Actualment s’estan estudiant altres estudis in vivo sobre models animals patològics per avaluar les conseqüències de la neutralització d’estratègies anti-TWEAK sobre VC induïda per la uremia.

Image

Efectes pro-calpecífics de TWEAK / Fn14 en la calcificació in vitro h-VSMCs induïda per Pi: ​​una representació esquemàtica. En condicions pro-calcifiques, l'activació canònica de TWEAK / Fn14 NF κ B va promoure la transició osteogènica h-VSMCs, caracteritzada per la pèrdua de marcadors contràctils h-VSMC acta2 i myh11 i la regulació del marcador osteogènic bmp2, un fort activador del TNAP. Això es va associar amb un augment de l’activitat TNAP, que degrada l’inhibidor de calcificació PPi per alliberar Pi que és essencial per a la formació d’hidroxiapatita. L’activació canònica de NF κ B induïda per TWEAK / Fn14 també va augmentar l’expressió de Fn14, que podria amplificar les propietats pro-calciques de TWEAK. Tant l'actuació canònica com la no canònica de NF κ B van promoure l'activitat de MMP9, que afavoreix la degradació d'elastina in vivo . L’activació no canònica de NF κ B induïda per TWEAK / Fn14 afavoreix la pèrdua del fenotip contractil h-VSMCs. Per contra, l'activació no canònica de NF κ B va modular ni l'expressió bmp2 ni l'activitat TNAP ni l'expressió Fn14.

Imatge a mida completa

Materials i mètodes

VSMCs humans (h-VSMCs)

Els H-VSMC es van aïllar dels segments lliures de lesió d'aortes ascendents proximals mitjançant un mètode explant modificat. Es van obtenir 59 mostres després de la cirurgia de la vàlvula aòrtica. Els pacients van donar el seu consentiment per escrit de conformitat amb la legislació espanyola (PROTOCOL EO34 / 2013). L’estudi s’ajusta a la Declaració de Hèlsinki.

Assaig de mineralització

La mineralització de h-VSMCss (15000 cèl·lules / pou, plaques de 24 pous) es va induir per exposició durant 7 dies a un 1% de DMEM suplementat per FBS que contenia 3, 0 mmol / l Pi (condició precalcificada) o 1, 1 mmol / l Pi (no -condició específica). Es van afegir concentracions creixents de TWEAK humà recombinant (1-200ng / ml, Millipore, Bedford, MA, EUA) al medi de cultiu i es va avaluar la mineralització induïda per Pi. La meitat del medi de cultiu es renovava cada 2 dies. Es va realitzar la detecció i quantificació de la deposició de minerals mitjançant una tinció al·larina vermella. Breument, es van arreglar mostres (50% etanol 5 min, 95% etanol 5 min), es van tacar durant 5 min amb vermell Alizarina S (40 mmol / l, pH 4, 2), es van esbandir amb 50% etanol i es van fotografiar. A continuació, el vermell d’alizarina es va solubilitzar per incubació en un tampó que contenia 10 mmol / l de NaH2 PO 3 i un monohidrat d’hexadecilpiridini al 10% abans de llegir a 570 nm. Quan es va valorar la mineralització en h-VSMCss transfectada, es van realitzar transfeccions 24 h abans i 96 h després de la primera exposició al tractament d’interès. Per a experiments amb 10 μ mol / l U0126, es va afegir l'inhibidor cada 2 dies amb medis nous.

transfecció h-VSMCs

Els h-VSMC van ser transfectats amb siRNA diluït a OptiMEM (Gibco, Carlsbad, CA, EUA), utilitzant lipofectamina (Invitrogen, Paisley, Regne Unit). S'han utilitzat siRNA dirigits a Fn14, RelA i RelB (Invitrogen) a una concentració de 10, 50 i 20 nM respectivament. SiRNA revoltat (Ambion, Foster City, CA, EUA) va servir de control negatiu.

qRT-PCR

Es va extreure ARN total mitjançant el mètode de reactiu TRI (Sigma, St Louis, MO, EUA). A continuació, es va invertir 1 μ g d'ARN transcrit a l'ADNc mitjançant el 'Kit de transcripció inversa d'ADNc de gran capacitat' (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) segons les instruccions del fabricant. El primer inicial per a acta2, myh11, bmp2, spp1, mmp2, mmp9, tnfsf12 i GAPDH eren de Applied Biosystems. La PCR quantitativa va ser realitzada per 7500 PCR System en temps real amb el Prism 7000 System SDS Software (Applied Biosystems) i l’expressió RNA dels diferents gens es va corregir per GAPDH.

Western blot

Es van estimular H-VSMCs (60 000 cèl·lules / pou en plaques de sis pous) amb Pi i / o TWEAK. Les mostres es van homogeneïtzar després en tampó de lisi (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0, 2% Tritó X-100, 0, 3% NP-40, 0, 1 mM PMSF i 1 μ g / ml pepstatina A ) i separat per un 10-12% SDS-PAGE en condicions de reducció. Després de l’electroforesi, les mostres van ser transferides a membranes PVDF (Millipore), bloquejades amb 5% de llet desnatada en PBS / 0, 5% v / v Tween 20 durant 1 h, rentades amb PBS / Tween i incubades durant la nit a 4 ° C amb ratolí monoclonal anti-. ERK fosforilat (1: 250), conill policlonal anti-ERK2 (1/250), conill policlonal anti-p65 (RelA) (1/500), conill policlonal anti-RelB (1/500) (biotecnologia de Santa Cruz, Santa Cruz, CA, Estats Units), conill monoclonal antifosfat-NF κ B p65 (1: 500), conill policlonal anti-Fn14 (1: 1000), conill policlonal anti-NF κ B p52 / p100 (1: 1000) (Cèl·lula Senyalització, Danvers, MA, EUA o anti-TNAP policlonal de conill (1: 500) (Abcam, Cambridge, Regne Unit). Els anticossos es van diluir en 5% de PBS / llet de llet. Els blots es van rentar amb PBS / Tween i es van incubar amb un anticòs secundari conjugat amb peroxidasa de raux adequat (1: 2000, Amersham, Aylesbury, Regne Unit). Després de rentar-se amb PBS / Tween, es van desenvolupar taques amb el mètode de quimioluminescència (ECL) (Amersham, Aylesbury, Regne Unit) i es van sondar amb anticossos monoclonals anti- α- tubulina de ratolí (1: 2000, Sigma) o anticorp anti-GAPDH monoclonal del ratolí. (1: 3000, Millipore) seguint el mateix mètode i es van corregir els nivells d’expressió per a petites diferències en la càrrega.

Microscòpia confocal

Les monocapa H-VSMC de cobertors es van fixar en un 4% de paraformaldehid durant 10 min i es van treure a la glicina / PBS a 100 mmol / l durant 10 minuts addicionals. A continuació, les cèl·lules es van permeabilitzar en 0, 2% de Tritó X-100 / PBS durant 10 min. La unió no específica es va bloquejar per incubació en 1% BSA / PBS durant 30 min. Posteriorment, h-VSMCss es va incubar amb conill policlonal anti-RelA (1: 75), ratolí monoclonal anti-MYH11 (1: 50) o conill policlonal anti-TWEAK (1: 100) (Santa Cruz Biotechnology) durant 1 h, seguit. per 1 h d'anticòs secundari FITC (1: 200, Sigma). Els nuclis es van contrarestar amb iodur de propidi. Les cobertures es van muntar en diapositives de microscopi de vidre abans de la detecció fluorescent.

Activitat del TNAP

h-VSMCs (60000 cèl·lules / pou, plaques de sis pous) es van morir de fam durant la nit en un 1% de DMEM complementat amb FBS abans d’una exposició de 7 dies a 1, 5 ml de DMEM suplementat amb 1% de FBS que contenia o no 3 mmol / l de Pi i / o TWEAK. En total, es va afegir 750 µl de medi fresc cada 2 dies. L’activitat del TNAP es va mesurar amb el kit d’assaig de la fosfatasa pNPP (BioAssay Systems, Hayward, CA, EUA) tal com s’ha descrit anteriorment. 60

Zimografia en gel

Els H-VSMC es van cultivar com per a l'activitat del TNAP. Després de 7 dies, els sobrenedants h-VSMCs van ser centrifugats per eliminar les restes i es van diluir per dos per a l’avaluació de l’activitat MMP2. Les mostres es van concentrar 10 vegades amb un microcon de 10 kDa (Millipore) per a la detecció de l'activitat de MMP9. L’activitat de MMP es va avaluar mitjançant zimograma de gelatinasa en gel (gels de Zymogran, Life Technologies, Foster City, CA, EUA) tal com es descriu anteriorment. 17

Anàlisi estadística

Els resultats representen almenys tres experiments independents realitzats per triplicat mitjançant cèl·lules aïllades de diferents donants. Els resultats s’expressen com a mitjana ± SEM Les diferències entre grups es van avaluar mitjançant ANOVA unidireccional amb les proves post-hoc de Tukey mitjançant el programari Prism (Graphpad, Versió 5.0 GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Per a parells de paràmetres, les dades es van analitzar mitjançant la prova no parametrica de Mann – Whitney Es va considerar estadísticament significatiu un valor P <0, 05.

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Xifres suplementàries

Glossari

BMP2

proteïna morfogenètica òssia 2

CDC

malaltia renal crònica

Fn14

molècula inductible del factor de creixement de fibroblast 14

H-VSMC

cèl·lula del múscul llis vascular humà

MAPK

proteïna quinasa activada amb mitogen

MMP

matriu metaloproteinasa

PPi

pirofosfat

T2DM

diabetis mellitus tipus 2

TNAP

fosfatasa alcalina no específica del teixit

sTWEAK

soluble TWEAK

SEMPRE

Inductor feble d’apoptosi com el TNF

VC

calcificació vascular

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)