La regulació generalitzada de mir-665 afavoreix l’apoptosi i la colitis en la malaltia inflamatòria intestinal reprimint els components d’estrès del reticle endoplasmàtic xbp1 i ormdl3 | mort i malaltia cel·lular

La regulació generalitzada de mir-665 afavoreix l’apoptosi i la colitis en la malaltia inflamatòria intestinal reprimint els components d’estrès del reticle endoplasmàtic xbp1 i ormdl3 | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Apoptosi
  • Malaltia inflamatòria de l'intestí
  • miRNAs
  • Senyalització d’estrès

Resum

Els microRNA són reguladors crítics post-transcripcionals de l’expressió gènica i mediadors clau de la fisiopatologia de la malaltia inflamatòria intestinal (IBD). Aquest estudi té com a objectiu estudiar el paper del miR-665 en la progressió de la MII. L’anàlisi de PCR en temps real es va utilitzar per determinar l’expressió miR-665 en 89 mostres d’IBD acabades d’aïllar i teixits de mucosa colònica induïts per dextran sulfat de sodi (DSS). El paper de miR-665 en la inducció de l’apoptosi i la colitis va ser examinat per l’annexina V, TUNEL (etiquetatge de deoxinucleotidil-transferasa terminal dUTP), tinció de colònies in vitro i model de ratolines de colitis induïda per DSS in vivo. A més, es va realitzar un assaig reporter de la luciferasa, una anàlisi de blot occidental i una immunoprecipitació de microribonucleoproteïnes per determinar que miR-665 reprimia directament la XBP1 (proteïna-1 de la unió X-box) i ORMDL3. Aquí, els nostres resultats van revelar que miR-665 estava notablement regulat en colitis activa. Els estudis sobre guanys de funció i pèrdua de funció van demostrar que l'expressió ectòpica de miR-665 va promoure l'apoptosi sota diferents estímuls inflamatoris. És important destacar que es va promoure el lliurament de mímica miR-665, mentre que la injecció de antagomiR-665 va deteriorar notablement la colitis induïda per DSS in vivo . Mecànicament, vam demostrar que miR-665 va induir apoptosi mitjançant la inhibició de XBP1 i ORMDL3. En conjunt, els nostres resultats revelen un nou mecanisme regulador per a la senyalització d’estrès d’ER i suggereixen que miR-665 podria ser un objectiu potencial en la teràpia amb IBD.

Principal

La malaltia inflamatòria intestinal (IBD) és una malaltia complexa caracteritzada per una inflamació crònica o recurrent al tracte gastrointestinal. Els principals tipus d’IVD són la colitis ulcerosa (UC) i la malaltia de Crohn (CD). Tot i que la MII rarament és fatal per si sola, sovint no es pot curar mèdicament a causa de la inflamació crònica i pot augmentar el risc de càncer colorectal. Els avenços recents en la comprensió de la patobiologia amb IBD han demostrat que les interaccions basades genèticament entre les disfuncions de la barrera ambiental i / o epitelial causen l'activació persistent de les respostes immunes innates i adaptatives. 1 En particular, estudis recents han proporcionat evidències vàlides que vinculen l'estrès del reticle endoplasmàtic (ER) a la patogènesi de la MII. 2

L’estrès ER és un procés cel·lular desencadenat per una varietat de condicions que pertorben el plegament de proteïnes a l’ER. Per netejar proteïnes desplegades, la resposta de proteïna desplegada (UPR) restableix l’homeòstasi ER. La proteïna-unió X-box-binding (XBP1), un potent inductor d’un subconjunt de gens objectiu UPR, és necessària per al manteniment constitutiu de la funció ER en tots els tipus de cèl·lules i la supressió de XBP1 en cèl·lules epitelials intestinals (IECs) resulta en enteritis espontània. 3, 4 A més, la proteïna ORMDL3 es troba principalment a la ER i regula l'aplicació de Ca 2+ a partir del citosol i la senyalització de Ca 2+ mediada per ER. 5, 6 Recentment, estudis d'associació a tot el genoma van identificar ORMDL3 com un altre factor de risc genètic de CD i UC. S'ha informat que la pèrdua d'expressió XBP1 o ORMDL3 fomenta la colitis i augmenta la hipersensibilitat a l'apoptosi induïda per la citocina mitjançant la senyalització de la quinasa N-terminal kinasa (JNK). 2, 3, 8 Pel que fa als seus papers crítics en l'estrès ER i la patogènesi de la MII, una millor comprensió de la regulació de XBP1 i ORMDL3 podria proporcionar noves pistes sobre el pronòstic i la teràpia de la MII.

Posseint el seu paper de reprimir simultàniament una varietat de gens diana mitjançant la interacció amb els seus elements 3'-UTR de mRNA, microRNA (miRNA) ha estat involucrat en el desenvolupament i la progressió de l'IBD. 9, 10, 11 És de destacar, estudis recents suggereixen que els miRNAs regulen l’estrès ER i indueixen l’apoptosi. 12, 13 Per exemple, miR-15b-5p va reprimir la senyalització de la UPR mitjançant la supressió de Rab1A i l’apoptosi accelerada en el carcinoma hepatocel·lular humà. 14 Tanmateix, encara es desconeix si l’alteració de l’estrès ER mediada per miRNA contribueix a que la progressió de la MII no es conegui.

Sobretot, un estudi recent que compara l’alteració de l’expressió de miRNA va identificar que el miR-665 estava altament significativament regulat en les biòpsies colòniques mucoses de la UC activa; 15 Tanmateix, el seu paper encara no està clar. Aquí, utilitzant l'algorisme TargetScan, vam trobar que tant XBP1 com ORMDL3 són teòricament gens objectiu de miR-665. A més, vam demostrar que miR-665 regulava les expressions XBP1 i ORMDL3 dirigint directament els seus 3'-UTR, donant com a resultat l'activació de JNK. La pressió general de miR-665 afavoreix l’apoptosi i la colitis induïda per apoptosi i sulfat de dextran sodi (DSS) tant in vivo com in vitro , mentre que la inhibició de miR-665 indueix efectes oposats. En conjunt, aquests resultats suggereixen que miR-665 té un paper important en la regulació de l'estrès ER i pot representar un objectiu terapèutic per a la IBD.

Resultats

miR-665 està altament regulat en la mucosa inflamada de pacients amb IBD i colitis induïda per DSS en ratolins

Els ARNM estan sorgint com a reguladors importants de la patogènesi de la MII. Analitzant un perfil d’expressió de miRNA publicat publicament (NCBI / GEO / GSE48957; n = 27, incloent 10 controls normals i 17 mostres de UC), 15 vam trobar que els nivells de miR-665 es mantenien baixos en biòpsies de mucosa colònica normal, però es van incrementar a quatre vegades més pacients amb UC (Figura 1a). Després vam validar l'expressió miR-665 en teixits IBD mitjançant PCR en temps real. Com era d'esperar, l'expressió miR-665 es va incrementar substancialment, amb una regulació superior de 4 a 16 vegades en CD (CD inactiu, n = 21; CD actiu, n = 29) i UC (UC inactiva, n = 16; UC activa, n = 23) subgrups en comparació amb els controls normals i augmentats encara més en els pacients amb colitis activa (Figura 1b). D'altra banda, l'expressió miR-665 també es va incrementar per 6 vegades en els teixits de la mucosa colònica induïda per DSS. Així, aquests resultats suggereixen que la regulació generalitzada de miR-665 pot contribuir a la progressió de la MII.

Image

miR-665 està marcadament regulat en la mucosa inflamada de pacients amb IBD i colitis induïda per DSS en ratolins. ( a ) Els nivells de miR-665 es van mantenir baixos en biòpsies normals de mucositat colònica, però es van fer notablement més elevats en pacients amb UC avaluats per una microarray publicada (NCBI / GEO / GSE48957; n = 27, incloent 10 controls normals, 17 mostres UC). P <0, 001. ( b ) Anàlisi de PCR en temps real de l'expressió miR-665 en 50 CD (CD inactiu, n = 21; CD actiu, n = 29) i 39 UC (UC inactiu, n = 16; UC activa, n = 23) mostres en comparació amb els controls normals. Els nivells de transcripció es van normalitzar a l’expressió U6 . Les línies denoten el mitjà ± SD ** P <0, 05, *** P <0, 001, la prova t de l'alumnat de dues cues. ( c ) Anàlisi de PCR en temps real de l'expressió miR-665 en ratolins i controls de colitis induïts per DSS. Els nivells de transcripció es van normalitzar a l’expressió U6 . Les línies indiquen el mitjà ± prova de tall de SDT de dos cues

Imatge a mida completa

miR-665 sensibilitza l'apoptosi induïda per inflamacions in vitro

Atès que la MII es caracteritza per una inflamació mucosa difusa i una apoptosi cel·lular tant en CD com en UC, es va especular que el MiR-665 podria tenir un paper en l'apoptosi. Primer, varem exagerar de manera exògena miR-665 mitjançant transfecció mímica miR-665 (figura suplementària 1). De fet, els assajos de tinció de l’annexina V i TUNEL (deoxinucleotidil-transferasa terminal dUTP) demostren que l’expressió ectòpica de miR-665 augmentava les taxes apoptòtiques de les cèl·lules HT-29 i Caco-2 mitjançant la sensibilització a la DSS quimioagent (Figures 2a i b) ). A més, es va confirmar l'efecte de miR-665 en la promoció de l'apoptosi examinant els perfils de clivatge de procaspase-3 i poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) en cèl·lules HT-29 i Caco-2. Com es mostra a la figura 2c, es van augmentar les clivades tant de caspasa-3 com de PARP a les cèl·lules amb sobreexpressió de miR-665 tractades amb DSS. És important destacar que el test de formació de colònies va indicar que la sobreexpressió miR-665 va induir l’apoptosi de cèl·lules HT-29 en presència de DSS, factor de necrosi tumoral (TNF- α ) i lipopolisacàrid (LPS) en comparació amb els controls (figura 2d).

Image

miR-665 sensibilitza l'apoptosi induïda per inflamacions in vitro. ( a ) Tinció de l'annexi V-fluoresceïna isotiocianat (FITC) / iodur de propidi (PI) de les cèl·lules indicades tractades amb 2% de DSS durant 24 h. ( b ) Micrografies representatives (esquerra) i quantificacions (dreta) de cèl·lules positives amb TUNEL després de 24 hores de tractament amb 2% de DSS. ( c ) Transitació occidental d'expressió de caspasa-3 i PARP fenduda. α -Tubulina es va utilitzar com a control de càrrega. ( d ) Quantificació de colònies formades a les cèl·lules transfectades amb miR-665 i controls en presència del 2% de DSS, TNF- α (20 ng / ml) i LPS (1 μ g / ml). Les barres d’error representen el mitjà ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05

Imatge a mida completa

Per la seva banda, el paper del miR-665 en IBD es va examinar més endollant endògensament el miR-665 mitjançant la transfecció antagomiR-665 (figura suplementària 1). Vam trobar que silenciar miR-665 reduïa les taxes apoptòtiques de cèl·lules HT-29 i Caco-2 sota tractament DSS (figura 3a i b). De forma consistent, es van suprimir les clivades tant de la caspasa-3 com de la PARP a les cèl·lules silenciades miR-665 tractades amb DSS (figura 3c). A més, el nombre de colònies formades per cèl·lules silenciades per miR-665 va ser significativament més gran en comparació amb els controls sobre el tractament amb DSS, TNF- α i LPS (Figura 3d). En conjunt, els nostres resultats indiquen que la regulació general de miR-665 promou l’apoptosi induïda per inflamacions in vitro .

Image

El silenciament de miR-665 protegeix contra la mort de les cèl·lules in vit ro. ( a ) Les cèl·lules es van tractar amb DSS durant 24 hores i es van tacar amb isotiocianat de l'annexina V-fluoresceïna (FITC) / PI. ( b ) El silenciament de miR-665 va reduir el nombre de cèl·lules positives TUNEL després de 24 hores de tractament amb DSS. ( c ) Transitació occidental d'expressió de caspasa-3 i PARP fenduda. α -Tubulina es va utilitzar com a control de càrrega. ( d ) Quantificació de colònies cel·lulars formades a les cèl·lules transfectades amb antagomiR-665 i controls en presència de DSS, TNF- α (20 ng / ml) i LPS (1 μ g / ml). Les barres d’error representen el mitjà ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05

Imatge a mida completa

El miR-665 antagonitzant perjudica la colitis induïda per DSS in vivo

A continuació, es va examinar l'efecte promocional de miR-665 sobre la IBD in vivo i es va avaluar si antagonitzant miR-665 podria deteriorar la colitis induïda per DSS. Els ratolins van ser injectats intraperitonealment amb mímica miR-665, antagomiR-665 o control tres vegades a la setmana durant 2 setmanes. Una setmana després de la injecció, els ratolins van ser sotmesos a colitis induïda per DSS durant 10 dies. Es va observar la major pèrdua de pes corporal en els ratolins injectats amb el mímic miR-665, mentre que la injecció antagomiR-665 va inhibir significativament la pèrdua de pes corporal induïda per DSS (figura 4a). A més, els ratolins injectats amb miR-665 presentaven longituds de colon més curtes, pèrdua de l'estructura de la cripta, ulceració, infiltració de cèl·lules inflamatòries i un major índex d'apoptosi en comparació amb els controls (figures 4b – e). És important destacar que la inhibició de miR-665 reduïa el colon, la colitis i la mort de les cèl·lules induïda de manera robusta, in vivo (figures 4b – e). Aquests resultats suggereixen que miR-665 promou la colitis induïda per DSS i que antagonitzant miR-665 rescata les cèl·lules d’aquests efectes.

Image

El miR-665 antagonitzant inhibeix la colitis induïda per DSS in vivo. ( a ) Els canvis de pes corporal es mostren com a percentatges del valor de base i són els mitjans ± SEM, n = 8. ( b ) Deu dies després del tractament amb DSS, es van examinar els teixits del còlon. ( c ) La histologia mucosa es va examinar mitjançant tinció de H&E. ( d ) Puntuació de gravetat de colitis en cada grup. ( e ) L'índex apoptòtic (a la dreta) es va determinar mitjançant el percentatge de cèl·lules positives TUNEL (esquerra). Les barres d’error representen el mitjà ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05

Imatge a mida completa

miR-665 orienta els components d’estrès ER XBP1 i ORMDL3

Els avenços recents han revelat que la via d’estrès ER és una via cel·lular primitiva que manté la viabilitat cel·lular i l’homeòstasi del còlon. Curiosament, utilitzant l'algorisme TargetScan disponible públicament, vam trobar que els components bàsics de la ruta de senyalització UPR, XBP1 i ORMDL3 , poden ser objectius potencials de miR-665 (Figura 5a). L’anàlisi de Western Blotting va revelar que la sobreexpressió miR-665 va suprimir significativament els nivells d’expressió XPB1 i ORMDL3, però la inhibició de miR-665 va augmentar la seva expressió (figura 5b). Mentrestant, vam trobar que l’acumulació de XBP1 i ORMDL3 en ER cel·lular es va reduir notablement per la sobreexpressió de miR-665, però va augmentar per la seva inhibició (figura 5c). Tot i això, l'anàlisi de PCR en temps real va revelar que els nivells d'ARNm de XBP1 i ORMDL3 no es van canviar significativament en alteració de miR-665 (figura suplementària 2), cosa que suggereix que miR-665 inhibeix l'expressió XBP1 i ORMDL3 induint la repressió de la traducció.

Image

miR-665 orienta els components d’estrès ER XBP1 i ORMDL3. ( a ) La seqüència objectiu prevista de miR-665 a les 3′-UTR de XBP1 i ORMDL3 . S'indica el mutant miR-665 mutat (miR-665-mutant) que conté quatre nucleòtids alterats a la seqüència de llavors miR-665. ( b ) Taques occidentals d'expressió XBP1, ORMDL3, p-JNK i JNK. α -Tubulina servia com a control de càrrega. ( c ) Taques occidentals d'expressió XBP1 i ORMDL3 en les fraccions ER. ERP29 va servir de marcador d'ER. ( d ) Test de luciferasa de cèl·lules transfectades amb pGL3-XBP1-3′-UTR o pGL3-ORMDL3-3′-UTR reporter amb mític miR-665, antagomiR-665, control de mímica, control antagomiR o mutant miR-665. ( e ) Test IP de MiRNP que mostra l'associació entre transcripcions de miR-665 i XBP1 i ORMDL3 en cèl·lules HT-29. GAPDH va servir de control negatiu. Les barres d’error representen el mitjà ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05

Imatge a mida completa

Un estudi anterior ha trobat que la reducció de la XBP1 promou l’apoptosi mitjançant l’activació de JNK. 3 De manera consistent, vam trobar que l’expressió ectòpica de miR-665 augmentava la fosforilació de JNK (p-JNK), mentre que la inhibició de miR-665 va disminuir la fosforilació, cosa que suggereix que miR-665 promou l’apoptosi cel·lular mitjançant l’activació de JNK (Figura 5b). A més, el test de luciferasa va demostrar que la sobreexpressió de miR-665 va atenuar les activitats del reporter impulsades pels 3′-UTRs de XPB1 i ORMDL3, mentre que la inhibició de miR-665 va augmentar aquestes activitats (figura 5d). Tanmateix, l’expressió ectòpica del mutant miR-665 no va tenir efectes repressius sobre les activitats del reporter (Figura 5d). D'altra banda, un assaig d'immunoprecipitació (IP) de microribonucleoproteïna (miRNP) va revelar una associació selectiva de miR-665 amb XBP1 i ORMDL3 però no amb GAPDH (Figura 5e), indicant encara més els efectes específics del miR-665 sobre aquests objectius. Aquests resultats suggereixen que miR-665 va dirigir directament la XBP1 i ORMDL3.

XBP1 i ORMDL3 són efectors funcionals per l’apoptosi induïda per miR-665

A continuació, es va explorar la importància funcional de la repressió de XBP1 i ORMDL3 en l'apoptosi de cèl·lules del colon. Com es mostra a les figures 6a i b, el silenciament de XBP1 o ORMDL3 a les cèl·lules del colon HT-29 i Caco-2 va augmentar la sensibilitat de l’apoptosi induïda per DSS. Mentrestant, les cèl·lules silenciades XBP1 o ORMDL3 van formar més colònies sota tractament DSS (figura 6c). A més, es va trobar que la restauració tant de l’expressió XBP1 com d’ORMDL3 va suposar l’efecte estimulador de miR-665 sobre l’apoptosi cel·lular, tal com indiquen els assajos de formació de la annexina V, TUNEL i colònia (Figures 6d-f). D'altra banda, qualsevol silenciament de XBP1 o ORMDL3 va promoure l'apoptosi cel·lular en cèl·lules inhibides de miR-665 (figura suplementària 3A – C).

Image

XBP1 i ORMDL3 són efectors funcionals per l’apoptosi induïda per miR-665. ( a i b ) Annexin V ( a ) i TUNEL ( b ) assajos de tinció que indiquen que el silenciament de XBP1 o ORMDL3 va promoure l’apoptosi cel·lular de cèl·lules del colon. ( c ) Quantificació de colònies formades a les cèl·lules silenciades XBP1 o ORMDL3 en presència de DSS. ( d i e ) Annexin V ( d ) i TUNEL ( e ) assajos de tinció que indiquen que tant l'expressió XBP1 com ORMDL3 abrogen l'apoptosi induïda per miR-665. ( f ) Quantificació de colònies en cèl·lules indicades. Les barres d’error representen el mitjà ± SD de tres experiments independents. * P <0, 05

Imatge a mida completa

Col·lectivament, aquestes troballes indiquen que la regulació del miR-665 promou la progressió de la IBD en inactivar la senyalització d’estrès ER mitjançant l’orientació de XBP1 i ORMDL3, i miR-665 podria ser un objectiu terapèutic potencial.

Discussió

L’estrès d’ER s’observa en moltes malalties humanes, com la inflamació, malalties neurodegeneratives, malalties metabòliques i càncers, i s’identifica que la UPR, un eix de senyalització de tres puntes, per preservar l’homeòstasi ER. Aquestes respostes a l'estrès estan involucrades en diversos processos cel·lulars, incloent la síntesi de proteïnes, taxes de degradació, plegament i secreció, i després indueixen a la migració cel·lular, la transformació cel·lular, l'angiogènesi i la mort cel·lular. 17 Notablement, per a l’epiteli intestinal, l’estrès ER s’indueix característicament per causes primàries (genètiques) associades a l’UPR, com XBP1, ORMDL3 i ARG2, o factors secundaris (ambientals), incloent toxines bacterianes (per exemple, subAB), mucines ( per exemple, MUC2), proteïnes autofàgiques (per exemple, ATG16L1) i citocines (per exemple, TNF- α i interleukina-10), i la interacció d'aquests factors inicia les cascades d'inflamació que poden causar o agreujar l'estrès ER homeostàtic. A més, la mort cel·lular sempre es produeix si no es pot restablir l’homeòstasi. Així, l'estrès ER té un paper important en el desenvolupament de la inflamació intestinal associada a la MII. Tot i que s’han aconseguit grans avenços en la comprensió de l’estrès per ER, el mecanisme regulador per a la desregulació de l’estrès ER en IBD encara no està clar. En aquest estudi, vam trobar que el miR-665 estava regulat en mostres d’IBD i que va reprimir substancialment els components de l’estrès ER, XBP1 i ORMDL3, donant lloc a l’augment de l’apoptosi mitjançant l’activació de JNK. Per tant, el nostre estudi presenta un nou mecanisme per a la modulació de la senyalització d’estrès ER, que pot ser un objectiu terapèutic prometedor per a la IBD.

Els avenços recents han proporcionat noves visions sobre la comprensió dels mecanismes de mort cel·lular induïda per l’estrès ER i es suggereix que alguns miRNA actuen com a supressors de la mort cel·lular mediada per l’estrès ER. 20 Tot i que la interacció de miRNAs i resposta a l’estrès ER necessita una investigació més profunda, vam identificar que miR-665 tenia com a objectiu XBP1 i ORMDL3, que es trobaven en vies de senyalització diferents de respostes d’estrès ER, després va activar l’expressió de JNK, donant conseqüència a l’apoptosi. De fet, es va informar que l’àcid 4-fenil butíric (un medicament aprovat per la FDA per a trastorns del cicle de la urea) i l’àcid ursodeoxicòlic conjugat amb taurina (TUDCA) redueixen l’estrès ER in vivo utilitzant models murins d’obesitat i diabetis tipus 2. Hem trobat que diversos assajos clínics s’han centrat en el paper de TUDCA en els subjectes que són diabetis tipus 1 o resistència a la insulina associada a l’inhibidor de la proteasa. Curiosament, l’administració oral de TUDCA va millorar la inflamació en un model de rosegadors d’inflamació intestinal primària, i després l’estrès ER pot ser un mecanisme important en la patologia d’IBD. 22 En el nostre estudi, l'expressió miR-665 es va registrar notablement en la colitis experimental, però antagonitzant miR-665 redueix la gravetat de la colitis. Per tant, els nostres resultats suggereixen que miR-665 pot representar-se com a objectiu terapèutic potencial per a IBD.

Com ja sabem, p53 és el principal porter de l’apoptosi cel·lular. Tanmateix, es troba l'estrès ER que indueix l'apoptosi principalment mitjançant l'activació de la senyalització JNK, que al seu torn regula l'expressió de BCL2 i BAX, provocant la mort cel·lular mediada per mitocondris. En aquest context, aquí hem utilitzat les cèl·lules HT-29 mutants p53 i p53-null Caco-2 per investigar l’alteració de la senyalització d’estrès ER per miR-665. Notablement, vam trobar que miR-665 reduïa l’expressió de XBP1 i ORMDL3, i va augmentar l’activitat de JNK, donant lloc a una major sensibilitat de l’apoptosi cel·lular per factors inflamatoris. Així, aquestes troballes van revelar que l'eix miR-665 / ER / JNK va tenir un paper important en la progressió de la MII independent de la p53.

Les evidències recents indiquen que el miR-665 estava regulat en l'adenocarcinoma gàstric intestinal. 24 S'informa que la MII té el risc de desenvolupar càncer associat a la colitis (CAC), i la incidència creixent de càncer ha estat fins al 20%. 25 Polytarchou et al . 26 recentment han descobert que miR-214 estava sobreexpressada per l'activació de senyalització IL-6 / STAT3 i va modular les expressions de fosfatasa i tensió homolog (PTEN), domini PDZ i LIM 2 (PDLIM2) i fosforilació d'AKT, cosa que va induir l'activació de factor nuclear- κ B (NF- κ B). A més, van demostrar que la senyalització es correlaciona amb la progressió al càncer colorectal. Mentrestant, la família de factors de transcripció NF- B és un important iniciador de la inflamació per estrès ER, la qual cosa produeix TNF- α proinflamatòria i aguditza la mort cel·lular induïda per l’estrès. 27 Curiosament, els nostres resultats van indicar que l’expressió ectòpica de miR-665 va promoure l’apoptosi sota diferents estímuls inflamatoris, com el TNF- α . Tanmateix, encara no se sap si el miR-665 podria tenir un paper en el desenvolupament de la CAC a través dels efectes dels factors inflamatoris. Cal fer esforços per examinar el paper crucial del miR-665 en la progressió del CAC.

La microbiota és considerada com la causa principal de la MII. Curiosament, es va informar que la microbiota va ser induïda per miR-665, que al seu torn va facilitar la infecció al desregular Abcc3 a les cèl·lules hoste, 29 cosa que suggereix que miR-665 podria ser un mediador important en la IBD induïda per microbiotes. D'altra banda, l'estrès ER té diversos mediadors en immunitat, incloent-hi la producció de citocines proinflamatòries. En particular, analitzant la regió promotora miR-665 mitjançant el programa CONSITE, es van trobar diversos llocs típics d’enquadernació NF- κ B, cosa que suggereix que miR-665 podria estar regulat per la via de senyalització inflamatòria NF-B B. Així, miR-665 podria induir una regulació de retroalimentació positiva en el bucle miR-665 / ER / NF-B, provocant una inflamació crònica al tracte gastrointestinal. Tot i que aquestes hipòtesis són grans indicacions a seguir, però, queda fora de l’abast del nostre projecte actual i, per tant, s’investigarà en les nostres futures investigacions.

En conclusió, el nostre estudi va demostrar que miR-665 és un regulador crític de la senyalització d’estrès d’ER i promou la patogènesi en IBD. Entendre el paper precís del miR-665 en la patogènesi d’IBD i en la resposta a l’estrès ER promet augmentar el nostre coneixement de la base biològica del desenvolupament de la inflamació i també pot facilitar el desenvolupament de noves estratègies terapèutiques contra la MII.

Materials i mètodes

Biòpsies i consideracions ètiques del pacient

Es va contractar a pacients amb malaltia amb IBD i subjectes no controlats amb IBD amb el consentiment informat i escrit per a aquest estudi al Primer Hospital Afiliat de la Universitat Sun Yat-sen. I, el Comitè d'Ètica de l'Hospital va aprovar el protocol d'estudi. Els exemplars inflamats de biòpsia es van obtenir de pacients diagnosticats de CD o UC seguint els criteris clínics, endoscòpics i histològics estàndard, inclosos 29 pacients amb CD actiu i 21 pacients en remissió i 23 pacients amb UC activa i 16 pacients en remissió. La gravetat de les malalties es va valorar segons els criteris estàndard internacionals, com l'índex d'activitat de la malaltia de Crohn per al diagnòstic de pacients amb CD, i els índexs de Mayo per a pacients amb UC. Es van obtenir mostres de control de pacients sotmesos a colonoscòpia com a part d’un programa rutinari de vigilància de pòlip sense patologia gastrointestinal activa.

Anàlisi de taquilla occidental

Les cèl·lules es van collir en tampó de lisi cel·lular (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) i es van escalfar durant 5 min a 100 ° C. Les quantitats iguals de mostres de proteïna desnaturalitzades es van resoldre en gels SDS-poliacrilamida del 10% i després es van transferir a membranes de difluorur de poliviniliden (Roche, Basilea, Suïssa). Després de bloquejar-se amb 5% de llet seca sense greixos en TBS / 0, 05% de Tween-20, les membranes van ser incubades amb un anticòs primari específic seguit d'un anticorp secundari conjugat amb peroxidasa de rave. Les proteïnes es van visualitzar mitjançant reactius ECL (Pierce, Rockford, IL, EUA). Es van comprar a Abcam (anticamis, MA, EUA) Els anticossos contra la caspasa escindida 3, els PARP, XBP1, ORMDL3, ERP29, p-JNK i JNK, es van comprar. Les membranes van ser desposseïdes i reprobades amb un anticòs anti- α- tubulina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) com a control de càrrega.

extracció de miRNA i PCR quantitativa en temps real

El miRNA total de teixits de còlon fresc de biòpsia es va extreure amb un isolant mirRana miRNA Kit (Ambion, Austin, TX, EUA) segons les instruccions del fabricant. Vam sintetitzar l’ADNc a partir d’ARN total de 10 ng mitjançant un kit de transcripció inversa de TaqMan miRNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) i vam quantificar els nivells d’expressió de miR-665 mitjançant un TaRMan MiRNA Asset Kit (Applied Biosystems) . L'expressió de miRNA es va definir a partir de la Ct, i els nivells d'expressió relatius es van calcular com a 2 - [(Ct de miR-665) - (Ct d'U6)] després de la normalització en referència a l'expressió d'ARN nuclear petit U6.

Prova de TUNEL

Es va examinar la fragmentació de l’ADN apoptòtic mitjançant un kit d’assaig del sistema fluoromètric TUNEL Fluorometric DeadEnd in situ (Promega, Madison, WI, EUA) segons el protocol del fabricant. Breument, les cèl·lules es van xapar en plaques de fons pla de 24 pous i es van tractar amb 2% de DSS durant 24 hores. Les cèl·lules es van fixar en un 4% de paraformaldehid a 4 ° C durant 30 min, es van permeabilitzar en Tritó X-100 al 0, 1% i es van marcar amb fluoresceïna-12-dUTP mitjançant la desoxinucleotidil-transferasa terminal. La fluorescència verda localitzada de les cèl·lules apoptòtiques de la fluoresceïna-12-dUTP es va detectar per microscòpia de fluorescència (Axiovert 100 M; Zeiss, Oberkochen, Alemanya).

El model de colitis induït per DSS

Els ratolins C57BL / 6 (entre 6 i 8 setmanes d’edat, entre 18 i 20 g) van ser adquirits al Centre d’Animals Experimentals de la Universitat de Medicina Xinesa de Guangzhou i es van allotjar en instal·lacions de barrera en un cicle de llum fosca de 12 hores. El Comitè Institucional de Cura i Ús dels Animals de la Universitat Sun Yat-sen va aprovar tots els procediments experimentals. Els ratolins van ser assignats aleatòriament a grups ( n = 8 per grup). Els ratolins dels grups es van injectar intraperitonealment amb mímica de 100 μ l miR-665, antagomiR-665 o control negatiu (diluït en PBS a 2 mg / ml) tres vegades per setmana durant 2 setmanes. Després d'una setmana, els ratolins van ser sotmesos a tractament amb 2% DSS durant 10 dies. Es van calcular els pesos dels ratolins. Els animals van ser llavors assassinats i els teixits del còlon van ser excisos i incrustats en parafina. Les seccions dels teixits del còlon van ser sotmeses a una tinció d’hematoxilina i eosina (H&E) i el test de TUNEL. Es va mesurar l'extensió de la inflamació i es va anotar com es va descriure anteriorment, 30 i es va mesurar l'índex apoptòtic en funció del percentatge de cèl·lules positives TUNEL.

Test de Luciferasa

Les cèl·lules (4 × 10 4 ) es van sembrar per triplicat en plaques de 24 pous i es van cultivar durant 24 hores. Les cèl·lules es van transfectar amb 100 ng de pGL3-XBP1-3′-UTR o pGL3-ORMDL3-3′-UTR plasmidi luciferasa més 5 plasmes de Renilla pRL-TK de 5 ng (Promega) mitjançant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) segons les recomanacions del fabricant. Els senyals de Luciferasa i Renilla es van mesurar 36 hores després de la transfecció mitjançant un Kit d’assaig Dual Luciferase Reporter (Promega) segons el protocol del fabricant.

immunoprecipitació miRNP

Les cèl·lules es van co-transfectar amb HA-Ago1 juntament amb miR-665 de 100 nM, seguida de la immunoprecipitació HA-Ago1 utilitzant un anticòs contra HA. L’anàlisi de PCR en temps real del material immunoprecipitat es va utilitzar per provar l’associació de l’ARNm de XBP1 i ORMDL3 amb el complex RISC.

Anàlisi estadística

Totes les anàlisis estadístiques es van realitzar mitjançant el paquet de programari estadístic SPSS versió 19.0 (SPSS lnc., Chicago, IL, EUA). Les dades s’expressen com el mitjà ± SD Les comparacions entre grups es van realitzar amb una prova de t d’ alumne de dos cues no aparellada. En tots els casos, es va considerar estadísticament significatiu un valor P <0, 05.

Informació complementària

Arxius d’imatges

  1. 1.

    Figura suplementària 1

  2. 2

    Figura complementària 2

  3. 3.

    Figura complementària 3

    La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)