El perfil de l'expressió del genoma sencer de la línia cel·lular transfectada per virus de l'hepatitis b revela els possibles objectius dels fàrmacs anti-VPH | la revista farmacogenòmica

El perfil de l'expressió del genoma sencer de la línia cel·lular transfectada per virus de l'hepatitis b revela els possibles objectius dels fàrmacs anti-VPH | la revista farmacogenòmica

Anonim

Resum

La infecció pel virus de l'hepatitis B (VHB) és una de les principals preocupacions per a la salut a tot el món i s'han desenvolupat pocs tractaments efectius. Recentment s'ha informat que la inhibició de proteïnes de les cèl·lules hostes pot prevenir la infecció vírica. El genoma humà pot contenir més gens necessaris per a la infecció i replicació del VHB que el genoma viral. Un enfocament sistemàtic per trobar aquests objectius antivirals potencials és mitjançant l'anàlisi de l'expressió gènica de l'amfitrió mitjançant microarrays d'ADN. L’objectiu d’aquest estudi era identificar i validar nous objectius cel·lulars anti-VHB. El Bioarray Human Whome Genoma es va utilitzar per analitzar gens expressats de manera diferent a les cèl·lules HepG2.2.15 i a les cèl·lules HepG2. Es va estudiar l'expressió gènica alterada en les cèl·lules HepG2.2.15 després del tractament amb lamivudina, un medicament anti-VHB. Els gens que es van expressar diferencialment durant la infecció per VHB i revertien amb fàrmacs anti-VHB es van validar mitjançant PCR de transcripció inversa semiquantitativa. L’anàlisi bioinformàtica va revelar ABHD2, EREG, ACVR2B, CDC34, KHDRBS3 i RORA com a objectius potencials anti-VHB cel·lulars. Els oligodeoxinucleòtids antisens es van utilitzar per provar l'activitat antiviral d'aquests objectius potencials. Els resultats van suggerir fortament que la inhibició de ABHD2 o EREG va bloquejar significativament la propagació del VHB a les cèl·lules HepG2.2.15. Aquest estudi demostra que ABHD2 i EREG són essencials per a la propagació del VHB i proporciona una forta evidència que aquestes proteïnes es podrien utilitzar com a dianes potencials per a fàrmacs anti-VHB.

Introducció

Hepadnavirus és un petit virus que conté ADN hepatotròpic que es replica mitjançant un ARN intermedi. 1 El virus de l'hepatitis B humana (HBV), membre de la família dels hepadnavirus, és responsable de la infecció hepàtica aguda i crònica. La infecció crònica per VHB, que causa cirrosi hepàtica i carcinoma hepatocel·lular (HCC), és un gran problema de salut pública mundial. Tot i que hi ha disponibles una vacuna eficaç des de fa vint anys, i els intents de vacunació universal ja estan en marxa als països desenvolupats, hi ha aproximadament 350 milions de portadors d’hepatitis B. Les teràpies antivirals actuals per a portadors de VHB inclouen el tractament amb α -interferó o lamivudina; tanmateix, la resolució de malalties a llarg termini és decebedora a causa de les baixes taxes de seroconversió i el desenvolupament de mutants virals resistents als medicaments. 3 Hi ha una necessitat urgent de teràpies antivíriques més efectives que puguin reduir o eliminar completament la infecció vírica amb menys efectes secundaris. Tot i que hi ha una gran quantitat d’informació sobre el virus i el possible paper que poden tenir els factors d’amfitrió en el cicle de la vida infecciosa, 1, 4, 5, 6 la relació directa entre pacients infectats crònicament i interaccions host-patògens no s’entén malament. La tecnologia de microarrays d’ADN s’ha utilitzat per mesurar els nivells d’ARNm de milers de gens cel·lulars en una varietat de condicions experimentals. Aquest enfocament s’està utilitzant cada cop més per controlar l’expressió del gen cel·lular en resposta a infecció viral, expressió de gens virals o el tractament amb compostos antivirals com l’interferó. 7, 8, 9

En aquest estudi, es va realitzar un perfil d’expressió genètica genòmica a les cèl·lules HepG2 i a les cèl·lules HepG2.2.15 mitjançant la Bioarray del genoma humà complet. Les cèl·lules HepG2.2.15 que es transfecten amb el genoma del VHB secreten estable els virions de l'hepatitis B i expressen totes les proteïnes del VHB. També es va analitzar el canvi d'expressió gènica a les cèl·lules HepG2.2.15, tant abans com després del tractament amb lamivudina. Les dades de Microarray van suggerir a més que un conjunt de gens està implicat en les respostes cel·lulars a la infecció del VHB. Finalment, vam comparar l'activitat anti-VHB dels oligodeoxinucleòtids antisens (ASODNs) amb gens seleccionats tant en els nivells d'ADN com de proteïnes per validar les nostres observacions dels experiments de perfils genètics. Es van identificar possibles gens de resposta del VHB i nous objectius per als medicaments contra el VHB.

Resultats

Efecte de la lamivudina en la replicació del VHB

Les cel·les HepG2.2.15 es van utilitzar com a control en blanc. Com es mostra a la figura 1, la lamivudina de 25 μ M va atenuar significativament la replicació del VHB, però va tenir poc efecte en la producció d’antígenos de superfície de l’hepatitis B (HBsAg) i la producció d’antigen de l’hepatitis B i antigen (HBeAg) en cèl·lules HepG2.2.15 8 dies després de la infecció.

Image

L’efecte de la lamivudina en la replicació del VHB. Les cèl·lules HepG2.2.15 van estar exposades a lamivudina de 25 μ M. Es va canviar de medi cada 4 dies amb compostos frescos de prova durant 8 dies. El medi es va recollir per als assajos de DNA HBsAg, HBeAg i HBV. L’ADN de VHB en el sobrenedant cel·lular va ser analitzat per PCR en temps real, mentre que els nivells de HBsAg i HBeAg van ser analitzats per ELISA. Els experiments es van realitzar per triple. Els nivells d’ADN de HBsAg, HBeAg i HBV al medi es van normalitzar pel nombre de cèl·lules i es mostren com la mitjana ± sd ( n = 3).

Imatge a mida completa

Citotoxicitat de lamivudina

Durant el tractament amb lamivudina, es va visualitzar la morfologia cel·lular cada dia mitjançant un microscopi. No es van observar diferències visibles entre la morfologia de les cèl·lules de prova i control. Els resultats del recompte de cèl·lules no van revelar diferències significatives entre elles ( P > 0, 05, n = 3). Així, no es va observar citotoxicitat visible en resposta a tractaments amb lamivudina de 25 μ M en cèl·lules HepG2.2.15 i HepG2.

Gens expressats diferencialment en les línies cel·lulars HepG2.2.15 i HepG2

Per estudiar els gens que es van expressar diferencialment entre la línia cel·lular HepG2.2.15 i la seva línia cel·lular parental, HepG2, es va utilitzar Amersham CodeLink Human Whole Genome Bioarray per comparar sistemàticament els perfils d’expressió gènica d’ambdues línies cel·lulars. Vam detectar que 2978 gens estaven regulats per almenys per dos o menys. D’aquests 2978 gens, 1358 gens tenien definides activitats funcionals (taula 1), mentre que 1620 gens eren noves etiquetes de seqüència expressades (EST) amb funcions desconegudes. Dels 1358 gens coneguts, 759 van ser regulats, mentre que 599 gens van ser regulats a la baixa. Aproximadament la meitat d’aquests gens es podrien classificar en categories funcionals, incloent-hi la transducció del senyal, el transport, l’adhesió cel·lular, el cicle cel·lular i el metabolisme cel·lular.

Taula completa

Efectes de la lamivudina en l’expressió del gen cel·lular HepG2.2.15

Vuit dies després del tractament amb lamivudina, es van observar canvis significatius en l'expressió de l'ARNm a les cèl·lules HepG2.2.15, amb 2465 gens al capdavant o regulats per almenys dos. Dels 2465 gens regulats de manera diferent, molts més van ser sobreexpressats (71%) que no expressats (29%) a les cèl·lules HepG2.2.15 després del tractament amb lamivudina. Més de la meitat (52%) dels gens diferenciats tenien funcions que no s’han caracteritzat. El 48% restant tenia nombroses funcions biològiques segons l’avaluació de Gene Ontology (GO), incloent el metabolisme cel·lular, el transport, la transducció del senyal, el cicle cel·lular, l’adhesió cel·lular, el creixement, l’apoptosi i les respostes immunes (taula 1).

Cribratge dels gens associats a la infecció pel VHB potencial i dianes possibles per a la teràpia anti-VHB

Es va comparar l'expressió gènica diferencial induïda pel tractament amb VHV i lamivudina amb el cribratge d'importants gens associats a la infecció pel VHB. Vam trobar que 22 gens estaven regulats a les cèl·lules de HepG2.2.15 i regulats per lamivudina (taula 2). Aquests poden ser importants gens associats a la infecció pel VHB i objectius potencials per a fàrmacs anti-VHB.

Taula completa

Validació de l’expressió de mRNA de gens seleccionats

Per assegurar el nivell d’expressió alterat, nou gens (KHDRBS3, EPC1, CDC34, ACVR2B, EREG, IGF2, TGFB1, RORA i ABHD2) van ser seleccionats i provats mitjançant transcripció inversa semiquantitativa (RT) -PCR (figura 2). Aquests gens van ser regulats a les cèl·lules de HepG2.2.15 i van ser regulats per lamivudina, reflectint les dades de la microarray. En canvi, els nivells de nou gens anteriors no van canviar òbviament en les cèl·lules HepG2 tractades amb lamivudina.

Image

Anàlisi RT-PCR de l'expressió de mRNA de gens seleccionats a partir de resultats de microarray. L’ARNm es va extreure de les cèl·lules HepG2.2.15, HepG2 i HepG2, HepG2.2.15 que van ser tractades amb lamivudina durant 8 dies. GAPDH es va utilitzar com a control. 2215 representa l'expressió gènica a les cèl·lules HepG2.2.15, G2 representa l'expressió gènica a les cèl·lules HepG2, G2 + Lam representa l'expressió gènica en cèl·lules HepG2 que van ser tractades amb lamivudina i 2215 + Lam representa l'expressió gènica en cèl·lules HepG2.2.15 que van ser tractades amb lamivudina.

Imatge a mida completa

La descregulació dels gens objectiu inhibeix la replicació del VHB

Per determinar si els nous gens cel·lulars són essencials per a la propagació del VHB, hem utilitzat ASODNs per a desgravar els nivells ABHD2, ACVR2B, CDC34, EREG, KHDRBS3 i RORA en les cèl·lules HepG2.2.15. Es va investigar l'efecte d'ASODNs sobre els nivells d'ARNm mitjançant RT-PCR semiquantitativa. El tractament de les cèl·lules HepG2.2.15 amb 0, 8 μ M AB3, AC2, C2, E3, K2 i R3 va restringir significativament els nivells d'ARNm regulats (Figura 3). L'efecte sobre la producció de VHB es va mesurar també en cèl·lules HepG2.2.15. Les cèl·lules transfectades amb 8 μ g / ml de lipofectina o tractades amb 25 μ mol / l lamivudina es van utilitzar com a controls negatius i positius, respectivament. El tractament de les cèl·lules HepG2.2.15 amb 0, 8 μ mol / l AB3 i E3 contra ABHD2 i EREG, va reduir greument el DNA HBV, HBsAg i HBeAg en els mitjans de cultiu cel·lular, respectivament. Tot i això, el tractament amb 0, 8 μ mol / l dels altres ASODN no va tenir cap efecte significatiu en la propagació del VHB (la taxa inhibitòria mitjana va ser <50%, Figura 4). Les taxes mitjanes d’inhibició del DNA HBV, HBsAg i HBeAg en 0, 8 μ mol / l AB3 van ser 65, 50, 67, 47 i 53, 04%, respectivament. Després del tractament amb 0, 8 μ mol / l E3, es va inhibir el DNA de VHB, HBsAg i HBeAg per 61, 13, 59, 19 i 35, 36%, respectivament. El control de lipofectina va tenir un efecte mínim en els nivells de VHB a les cèl·lules HepG2.2.15. El control positiu, 25 μ mol / l lamivudina, va inhibir els nivells de DNA HBV, HBsAg i HBeAg en 71, 77, 22, 79 i 20, 85%, respectivament. Així, vam seleccionar ABHD2 i EREG com a gens associats a la infecció per VHB.

Image

Anàlisi RT-PCR de l'expressió d'ARNm de gens seleccionats després del tractament ASODN de cèl·lules HepG2.2.15. ABHD2 ( a ), ACVR2B ( b ), KHDRBS3 ( c ), CDC34 ( d ), EREG ( e ) i RORA ( f ) ARNm en cèl·lules HepG2.2.15 tractades amb ASODNs (0, 8 μ mol / l) i lipofectina (8 mg) / l) durant 72 h es va analitzar per RT-PCR. GAPDH es va utilitzar com a control per normalitzar l’ARN total. C representa el control negatiu, Lip representa el control de la lipofectina, M representa el marcador de l’ADN. El nombre de cada banda s'expressa en un percentatge del control de les cel·les, normalitzat amb el nivell GAPDH corresponent.

Imatge a mida completa

Image

Els efectes d’ASODN sobre la propagació del VHB a les cèl·lules HepG2.2.15. Les cèl·lules HepG2.2.15 es van transfectar amb ASODNs (0, 8 μ M), 3TC (lamivudina, 25 μ mol / l) o Llavi (lipofectina, 8 μ g / ml) durant 3 dies. L’ADN de VHB en el sobrenedant cel·lular va ser analitzat per PCR en temps real, mentre que HBsAg i HBeAg van ser analitzats per ELISA. El llavi representa el control de la lipofectina. Les dades representen la mitjana ± sd ( n = 3). Els asteriscs indiquen una diferència estadísticament significativa en comparació amb el control de la lipofectina ( * P <0.05).

Imatge a mida completa

Discussió

La infecció persistent per VHB resulta de la interacció entre el VHB i les cèl·lules hostes i condueix finalment al desenvolupament de cirrosi hepàtica i HCC. 10 Com que la interacció entre el VHB i les cèl·lules hostes està implicada en moltes vies de senyalització cel·lular, no s’ha definit del tot. 1, 11, 12, 13, 14 S’espera que la inhibició d’aquests processos cel·lulars tingués un efecte antiviral. L'evidència d'això s'estén per diversos tipus de virus diversos, incloent poxvirus, 15 herpesvirus, 16, 17, 18 retrovirus, 19 hepadnavirus 20, 21 i flavivirus. 22 A més, qualsevol medicament amb llicència que tingui com a objectiu un procés de malaltia humana afecta d’alguna manera el funcionament d’una cèl·lula o sistema d’òrgans. Així, en realitat, tenim una farmàcia preparada d’agents antivirals amb perfils de dades de seguretat definits.

La tecnologia Microarray ha proporcionat una oportunitat per analitzar les interaccions viral-amfitriona complexes a nivell global. El perfil de l'expressió gènica mitjançant microarrays d'ADN ha identificat gens que es regulen com a part de la resposta de les cèl·lules infectades i se sap que són objectius de medicaments. En aquest estudi, es va analitzar l'expressió diferencial de proteïnes de cèl·lules host induïdes per VHB. Utilitzant el Bioarray complet del genoma humà, es van obtenir 1679 gens regulats i 1299 gens regulats a les cèl·lules de HepG2.2.15. Simultàniament, Otsuka, 23 va utilitzar matrius d'ADNc de 2034 gens per a analitzar gens diferenciats entre les cèl·lules HepG2.2.15 i les cèl·lules HepG2. Va observar set gens regulats (0, 30%) (inclosos IGFII, AFP, ASGPR i FABP) i tres gens regulats (inclosos GTR2-2 i MDM2) en cèl·lules HepG2.2.15 (0, 13%). Els resultats de la desregulació IGFII i MDM2 són coherents amb els nostres resultats.

La lamivudina ha estat un medicament líder en el tractament de la infecció crònica per VHB durant l’última dècada. És un analògic de nucleòsids administrat per via oral que és altament eficaç per inhibir la síntesi d’ADN de VHB. Lamivudine dirigeix ​​selectivament la revers transcriptasa viral del VHB i bloqueja directament la replicació del genoma del VHB. En aquest estudi, la lamivudina es va utilitzar com una eina per inhibir l'expressió diferencial de gens induïda per factors d'infecció no VHB. Per analitzar els gens de les cèl·lules hostes que es veuen alterats per la infecció per VHB, es van estudiar canvis en l’expressió gènica en cèl·lules HepG2.2.15 tractades amb lamivudina. Es van obtenir 22 gens funcionals que van ser regulats a les cèl·lules HepG2.2.15 infectades amb VHB i van ser regulades després del tractament amb lamivudina. Molts dels gens seleccionats estan ben caracteritzats i tenen funcions molt variades com a components del cicle cel·lular, lligands, receptors, cinases i molècules de transducció de senyal, components del metabolisme, reguladors de transcripció i proteïnes de transport i desenvolupament. Per exemple, HBx va interactuar amb el factor de transcripció ATF3 per millorar la seva expressió. L’estimulació de 25 HBx de l’expressió gènica d’IGF-II i la producció autocrina d’IGF-II implica la fosforilació i l’activació del factor de transcripció de Sp1 mitjançant les proteïnes de la proteïna cinasa C i les vies de cinasa activades mitogen p44 / p42 i es pot implicar una major expressió del gen IGF-II en Patogènesi de malalties hepàtiques cròniques associades al VHB. 26, 27 HBx també va millorar l'expressió del factor de creixement transformant β 1 (TGF β 1). 28 HBxAg promou l'activitat de TGF β 1 regulant el TGF β 1 i regulant la α 2-macroglobulina. 29 Una relació entre els gens que queden i la infecció per VHB encara no s'ha informat.

També vam validar l’expressió diferencial de 9 dels 22 gens (ABHD2, EREG, ACVR2B, CDC34, KHDRBS3, RORA, EPC1, TGFB1 i IGF2) utilitzant RT-PCR semiquantitativa. Tots aquests gens van ser regulats per VHB i baixats després del tractament amb lamivudina de cèl·lules HepG2.2.15.

Es mostra que la infecció persistent per VHB afecta les vies i enzims de les cèl·lules hoste. Excloent els gens que anteriorment es van informar que compartien una estreta relació amb el VHB, vam descobrir que ABHD2, EREG, ACVR2B, CDC34, KHDRBS3 i RORA també compartien una forta relació amb la infecció pel virus del VHB i podrien ser crítics per ajudar a la propagació de la infecció hepàtica infectada per HBV. cèl · lules. Aquestes proteïnes poden servir d’objectiu potencial per a fàrmacs anti-VHB.

Generalment, els virus utilitzen enzims de cèl·lules hoste per a la replicació, inclosos els que tenen activitat catalítica de la hidratasa. La carboxipeptidasa N, una metaloproteasa plasmàtica, pot unir-se i activar el promotor principal del VHB. A més, l'enzim cel·lular, S -adenosil- L-homocisteïna hidrolasa, té un paper regulador important en les reaccions de metilació dependents de la S -adenosil- L-metionina. La inhibició de la S -adenosil- L-homocisteïna hidrolasa té un efecte antiviral, ja que la majoria de virus vegetals i animals requereixen una estructura de tapa metilada al extrem 5 'del seu ARNm per tal que es produeixi una replicació viral. Així, doncs, mitjançant la inhibició de la S -adenosil- L-homocisteïna hidrolasa, s’inhibeixen les metiltransferases codificades per virus implicades en la formació d’aquesta estructura del casquet metilat i s’alenteix la replicació viral. L’ABHD2, un membre de la família de proteïnes α / β hidrolases, té una forta activitat catalítica de la hidratasa. 33 Especulem, doncs, que ABHD2 pot participar en la replicació del VHB. D’altra banda, EREG és membre de la família de factors de creixement epidèrmic i és capaç de millorar l’activitat STAT1, augmentant l’expressió p21WAF1 / CIP1 i estancant cèl·lules en l’etapa G1. 34 Moltes investigacions han indicat que tant DHBV 35, 36 com HBV es repliquen de manera més eficient a les cèl·lules quiescentes 37, 38 que a les cèl·lules proliferadores. Així, especularíem que en inhibir l'expressió EREG, les cèl·lules proliferessin de l'estadi metabòlic.

Una reducció de l’expressió gènica pot disminuir la replicació del VHB. Per donar suport a les nostres especulacions, es va validar l'activitat antiviral de gens seleccionats mitjançant la tecnologia ASODN. Els ASODN es basen en la complementarietat de les construccions amb l'ARNm objectiu adequat. Existeixen diversos mecanismes d’acció que condueixen a efectes antisens, com la inhibició de la transcripció, la modulació del processament d’ARN, la inhibició de la traducció i la divisió selectiva de l’ARNm objectiu mitjançant l’endonucleasa cel·lular, RNaseH. 39 Inicialment es van seleccionar ASODNs objectius anti-VHBV contra els sis gens anteriors per inhibir l'expressió gènica i observar els efectes antivirals contra el VHB. La baixada de ABHD2 i EREG per ASODNs va inhibir significativament la propagació del VHB, mentre que la regulació baixa de ACVR2B, CDC34, KHDRBS3 o RORA va tenir un efecte reduït en la propagació del VHB. Així, és probable que ABHD2 i EREG siguin essencials per a la propagació del VHB, de manera que l'expressió inhibida redueix els nivells de VHB.

En resum, utilitzant el Bioarray del genoma humà complet, vam realitzar una anàlisi global de l’expressió gènica induïda pel VHB i la lamivudina. Com a resultat, es van identificar 22 gens importants relacionats amb la infecció per VHB. Vam validar nou gens, incloent IGF2, TGFB1, EPC1, ABHD2, ACVR2B, CDC34, EREG, KHDRBS3 i RORA mitjançant la tecnologia RT-PCR. Els ASODN dirigits a ABHD2 i EREG van inhibir significativament la propagació del VHB, respectivament. Així, conclouríem que ABHD2 i EREG són essencials per a la propagació del VHB i poden servir com a objectius potencials per a fàrmacs anti-VHB.

Dualitat d’interès

Cap declarat.