Autofàgia wipi-dependent durant la diferenciació de neutròfils de cèl·lules de leucèmia promielocítiques agudes de nb4 | mort i malaltia cel·lular

Autofàgia wipi-dependent durant la diferenciació de neutròfils de cèl·lules de leucèmia promielocítiques agudes de nb4 | mort i malaltia cel·lular

Anonim

Temes

  • Autofagia
  • Senyalització cel·lular
  • Leucèmia
  • Neutròfils

Resum

Els membres de la proteïna que repeteix WD que interaccionen amb la família de fosfoinositides (WIPI) són efectors de fosfatidilinositol 3-fosfat (PI3P) que són essencials per a la formació dels autofagosomes. Els autofagosomes, orgànuls únics de doble membrana, són característics per a l’autofagia, un mecanisme de degradació massiva amb funció citoprotectora i homeostàtica. Tots dos, WIPI-1 i WIPI-2 estan expressats de forma anormal en diversos tumors sòlids, que vinculen aquests gens a la carcinogènesi. Ara vam trobar que l’expressió de WIPI-1 es va reduir significativament en una gran cohort de 98 mostres de pacients amb leucèmia mieloide aguda primària (AML) (cariotips complexos; t (8; 21); t (15, 17); inv (16) ). En canvi, l’expressió de WIPI-2 només es va reduir en la leucèmia promielocítica aguda (APL), un subtipus distint d’AML (t (15, 17)). Com que les cèl·lules AML es veuen bloquejades en la seva diferenciació, vam provar si els nivells d’expressió de WIPI-1 i WIPI-2 augmenten durant la diferenciació de neutròfils induïda per l’àcid trans retinoic (ATRA). Segons l'expressió WIPI-1 més elevada en granulocits en comparació amb cèl·lules explosives immadures, es va induir significativament l'expressió WIPI-1 però no WIPI-2 durant la diferenciació de neutròfils de cèl·lules APL NB4. Curiosament, la inducció de l’expressió WIPI-1 va dependre del factor de transcripció PU.1, un regulador principal de mielopoiesi, donant suport a la nostra idea que es redueix l’expressió WIPI-1 en pacients amb LAM que no disposen d’activitat PU-1 adequada. A més, la derrota de WIPI-1 a les cèl·lules NB4 va atenuar notablement el flux autòfag i va reduir significativament la diferenciació de neutròfils. Aquest resultat es va aconseguir també derrotant el WIPI-2, cosa que suggereix que tant el WIPI-1 com el WIPI-2 són necessaris funcionalment i no redundants en la mediació del senyal PI3P a l’aparició de l’autofàgia a les cèl·lules NB4. En línia amb aquestes dades, la regulació inferior de PI3KC3 (hVPS34), que genera PI3P aigües amunt de les WIPIs, també va inhibir la diferenciació de neutròfils. En conclusió, demostrem que es necessita tant WIPI-1 com WIPI-2 per a l’activitat autòfaga depenent de PI3P durant la diferenciació de neutròfils i que l’expressió WIPI-1 depenent de PU.1 està reprimida significativament en mostres de pacients amb AML primària i que la inducció del flux autòfag s’associa a la diferenciació de neutròfils de cèl·lules APL.

Principal

La macroautofagia (en endavant denominada autofagia), o autodigestió cel·lular, és: (a) implicada en el manteniment de l’homeòstasi cel·lular, (b) responsable d’una facturació constitutiva de material citoplasmàtic i proteïnes de llarga vida que estiguin danyades o funcionals. redundant, (c) altament conservat i (d) relacionat amb diverses malalties, inclosos els trastorns neurodegeneratius i el càncer. 1, 2, 3 La via ubiquitina-proteasoma, en canvi, participa més aviat en la degradació de les proteïnes de curta vida. 4 L’autofàgia consta principalment de quatre passos i segueix un reclutament ordenat jeràrquic de proteïnes relacionades amb l’autofàgia (ATG) al lloc de muntatge de fagòfors (PAS). En primer lloc, el pas d’inici comporta de manera crítica el complex ULK1, que regula el següent pas de nucleació mitjançant l’activació de la fosfatidilinositol 3-cinasa de la classe III (PI3KC3) kinases, donant lloc finalment a la formació d’un precursor autofagosoma, anomenat fagòfor. Altres passos inclouen l’activitat de dos sistemes de conjugació similars a la ubiquitina i el producte LC3-PE (o LC3-II) que es requereix per a l’allargament i tancament de fagòfors per generar un autofagosoma. 5

Durant el pas de nucleació, PI3KC3 actua en concert amb Beclin 1, VPS15 i ATG14L per produir PI3P. Aquest senyal PI3P és essencial per a la formació d’autofagomes, com ho demostra el fet que l’ús d’inhibidors de PI3K (wortmannina, 3-MA, LY29002) a concentracions que bloquegen preferentment l’autofàgia abolida per PI3KC3 6, 7, 8 (revisada en Petiot et al. 9 ) . La transducció del senyal PI3P es produeix a través d'efectors específics que lliguen PI3P, inclosa la proteïna del domini FYVE DFCP1 10 i la proteïna WDI que repeteix en interacció amb la família de proteïnes beta-hèlixs de fosfooinositides (WIPI). 11 La família WIPI humana està formada per quatre membres (WIPI-1 a WIPI-4) amb diferents isoformes. 11 Fins ara, les proteïnes humanes WIPI-1, WIPI-2 i WIPI-4 es van associar funcionalment amb el procés d’autofàgia. 11, 12, 13, 14 proteïnes WIPI funcionen com a proteïnes efectores autòfages PI3P amb capacitat d’unió a la membrana autofagosòmica, 15 i d’aquesta manera es traslladen del citosol al PAS formant. Posteriorment es converteixen en proteïnes de membrana de membranes autofagosòmiques, visibles per microscòpia fluorescent com a estructures puntejades. 15

La leucèmia mieloide aguda (AML) es caracteritza per un bloc de diferenciació mieloide en diferents etapes i representa la leucèmia aguda més comuna en adults. Cal millorar la diferenciació actual i les teràpies citotòxiques per a l’AML, a excepció d’uns quants subgrups amb malalties genètiques favorables. Recentment, nosaltres i altres vam publicar que l’autofàgia és essencial per a la teràpia de diferenciació dels pacients amb APL, 17, 18, 19, 20, 21, una malaltia caracteritzada per la translocació t (15; 17) que es tradueix en l’expressió de la proteïna oncogènica de fusió PML-RARA. i una acumulació de cèl·lules promielocítiques. No obstant això, les dades sobre els mecanismes moleculars a la base d'aquesta autofagia associada a la diferenciació mieloide són escasses i es requereixen investigacions posteriors sobre aquesta via autofàgica particular.

Aquí, demostrem que és necessària una autofagia mediada per la WIPI dependent de PI3P per a la diferenciació de neutròfils de cèl·lules AML. Vam trobar que l’expressió de l’ARNm de l’IPMP està reprimida significativament en mostres d’AML clínica associades a un fenotip de diferenciació mieloide immadura. El funcionament genètic de WIPI o PI3KC3, però no de la funció Beclin 1, va donar lloc a una diferenciació significativa dels neutròfils de les cèl·lules APL. Les nostres dades proporcionen proves que l’autofàgia mediada per la WIPI és fonamental per a la diferenciació de leucèmies mieloides cel·lulars i està compromesa en l’AML.

Resultats

Expressió aberrant de la WIPI en mostres de pacients amb AML primària i inducció dependent de PU.1 de l'expressió WIPI-1 durant la diferenciació de neutròfils de cèl·lules APL

Sobre la base del paper crucial de les proteïnes WIPI com a efectors de PI3P en el procés d’autofàgia 11, 12, 13, 15 i els descobriments inicials, que tots els gens de la WIPI humana s’expressen de forma anormal i diferent en una varietat de tumors sòlids, 11 que vam quantificar. Expressió gènica WIPI-1 i WIPI-2 en mostres de pacients amb AML clínica. Vam trobar que l’abundància d’ARNm d’IPMP-1 es va reduir significativament a la nostra cohort de pacients amb LAM ( n = 98) en comparació amb l’expressió de WIPI-1 en granulocits sans ( n = 13; Figura 1a, panells de l’esquerra). Més detalladament, el missatge WIPI-1 es va desglossar en cariotip complex ( n = 24), t (8, 21) ( n = 20), t (15; 17) ( n = 20) i inv (16) ( n = 16) subtipus AML però no en cariotip normal AML ( n = 18; Figura 1a, plafons drets). En contraposició, l'expressió d'ARNm-WIPI-2 només es va inhibir significativament en pacients amb APL (t (15; 17)), un subtipus AML distint (figura suplementària 1a). A més, el WIPI-1 va ser tres vegades més alt expressat en granulocits sans en comparació amb cèl·lules progenitores CD34 + normals (figura 1a, panells esquerre), mentre que WIPI-2 es va expressar igualment en ambdues poblacions cel·lulars (figura suplementària 1a). En resum, es va trobar una associació positiva entre una expressió baixa de la WIPI-1 i un fenotip mieloide immadur.

Image

Es va detectar significativament una expressió de mRNA de WIPI-1 en mostres de pacients amb AML primària i es va detectar un augment de l’expressió WIPI-1 en el tractament amb ATRA de cèl·lules APL NB4. ( a ) Es van mesurar els nivells de granulocits de l'IPNI-1 de granulocits de donants sans i mostres de pacients amb LAM mitjançant qPCR. Les dades representen nivells d’expressió log2 i es van normalitzar als nivells d’expressió dels dos gens de neteja HMBS i ABL. Per a una millor llegibilitat, vam multiplicar els resultats per (−1) i vam excloure valors de Ct superiors a 40 (Δ C t = 40 − Ct WIPI-1 - (Mitjana C t HMBS i C t ABL1 ) × (−1)). ( b ) els nivells d'ARNm de l'expressió WIPI-1 es van mesurar en control, i les línies de cèl·lules AP4 tractades amb ATRA NB4, NB4-R2 al dia 4 mitjançant qPCR. Els valors es van normalitzar en el gen HMBS de neteja i es van donar com a expressió de mRNA multipli en relació amb el control del dia 4. ( c, d ) Es va detectar l'augment de la punxa WIPI-1 endògena mitjançant microscòpia confocal i es va quantificar més mitjançant el programari ImageJ. ( e ) PI3P: assaig d'unió de WIPI-1 de lisats cel·lulars procedents de cèl·lules NB4 tractades amb 1 μM ATRA durant 6 dies. Cada membrana es carregava amb un mateix lisat proteic total. MWU, * P <0, 05. ** P <0, 01, *** P <0, 001. Test MWU, Mann – Whitney U

Imatge a mida completa

Per avaluar funcionalment el paper de WIPI-1 i WIPI-2 en la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA de cèl·lules de leucèmia mieloide, hem utilitzat les cèl·lules APL NB4 com a model. Les cèl·lules NB4 es diferencien cap a les cèl·lules similars als neutròfils mitjançant l'administració d'ATRA. En línia amb una expressió WIPI-1 més elevada en neutròfils madurs en comparació amb les explosions d'AML o les cèl·lules progenitores CD34 + (Figura 1a), el tractament amb ATRA de les cèl·lules NB4 va donar lloc a una regulació significativa de tres i quatre vegades més gran de mRNA de WIPI-1 els dies 4 i 6, respectivament (Figura 1b, panell superior). És important destacar que els nivells d'ARNm WIPI-1 no van canviar en les cèl·lules NB4-R2 resistents a l'ATRA (Figura 1b, plafó inferior) que indica que la regulació de l'expressió WIPI-1 no es deu a una resposta d'estrès estocàstica a l'administració ATRA. Finalment, els nivells d'ARNm-WIPI-2 no van canviar durant la diferenciació de neutròfils de les cèl·lules NB4 ni en les cèl·lules NB4-R2 (figura suplementària 1b).

Per controlar l'estat autòfag, es va valorar la localització de proteïnes endogènes WIPI-1 en cèl·lules NB4 durant la diferenciació de neutròfils per immunocitoquímica. Amb aquest mètode d’imatge, la presència de WIPI-1 fluorescent reflecteix de forma fiable la formació de membranes autofagosòmiques. 15 De fet, es va mesurar un augment significatiu de WIPI-1 puncta per cèl·lula en la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA (Figura 1c i d). Com que el WIPI-1 s'uneix específicament a PI3P, 15 ens vam preguntar si l'expressió WIPI-1 augmentada al tractament amb ATRA (figura 1b, panell superior) donaria lloc a una proporció més alta de proteïna WIPI-1 a unió de PI3P. De fet, un assaig de superposició de proteïnes fosfolípides amb extractes de cèl·lules natives va revelar que la proteïna endogènia WIPI-1 de cèl·lules APL tractades amb ATRA NB4 tractades amb més importància a PI3P immobilitzada en comparació amb cèl·lules no tractades ( n = 3, es proporciona un resultat representatiu a la figura 1e ). Satisfactori, aquest resultat també va confirmar que la WIPI-1 endògena extreta de l’APL NB4 s’uneix correctament a PI3P.

Per provar si es pot atribuir una expressió baixa de WIPI-1 en explosions d’AML immadures a una regulació transcripcional aberrant per factors de transcripció mieloide, es va analitzar la regió genòmica de 5, 8 kb aigües amunt del lloc d’inici transcripcional de WIPI-1 per a llocs d’unió putatius del factor de transcripció mieloide clau. PU.1 mitjançant MatInspector. S'han identificat 4 llocs d'unió PU.1 positius (A – D) a la regió 5'-promotora de la WIPI-1 (Figura 2a). Mitjançant l'ús d'immunoprecipitació de cromatina i anticossos anti-PU.1, es va trobar la unió de PU.1 a tots els 4 llocs d'unió PU.1 (A – D) en el promotor 5'de la WIPI-1 humana (Figura 2b). Per tal de mostrar la regulació de l’expressió WIPI-1 depenent de PU.1, vam eliminar o sobreexpressar PU.1 a les cel·les APL NB4. Assolir la inducció deteriorada de PU.1 de l'expressió del gen WIPI-1 després del tractament amb ATRA (Figura 2c), mentre que el tractament amb tamoxifen de la proteïna de fusió PU.1-ER inductible va comportar una inducció doble de l'expressió WIPI-1 (Figura 2d).

Image

Regulació WIPI-1 dependent de PU.1 a cèl·lules APL NB4. ( a ) Representació esquemàtica d'un fragment de promotor WIPI-1 humà de 5, 8 kb. Mitjançant MatInspector, es troben en el promotor WIPI-1 humà 4 llocs putatives d’unió PU.1 (cercles). ( b ) La unió in vivo de PU.1 als 4 llocs d’unió va ser mostrada per ChIP en cèl·lules NB4 utilitzant anticossos contra PU.1. Els anticossos contra acetil-histona H3 i IgG van servir de control positiu i negatiu, respectivament. L’amplificació GAPDH es va mostrar com un control negatiu per als diferents desavantatges. ( c ) Panell superior: es va mesurar l'expressió de l'ARNm-WIPI-1 en cèl·lules knockdown NBP shPU.1 després del tractament amb ATRA el dia 4. Panell inferior: anàlisi Western blot PU.1 del control NB4 SHC002 i cèl·lules knockdown PU.1. Es va utilitzar l'expressió de proteïna total com a control de càrrega. ( d ) Cèl·lules NB4, transduïdes amb un vector que expressa PU-1-ER inductible, es van tractar amb 4-OHT per induir la transferència de PU.1 al nucli. Els nivells d'ARNm-WIPI-1 es van avaluar per qPCR i es van normalitzar al gen de manteniment de la llar de HMBS. Els resultats es donen com a regulació multiplicada en comparació amb cèl·lules de pBabe NB4 que no han estat tractades i controlades. MWU, *** P <0, 001. Test MWU, Mann – Whitney U

Imatge a mida completa

Junts, vam trobar que PU.1 regula l'expressió WIPI-1 durant la diferenciació de neutròfils.

La inhibició del WIPI-1 o WIPI-2 atenua significativament la diferenciació de neutròfils

Vam abordar la pregunta de si es necessita o no WIPI-1 per a la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA mitjançant l'ús de shRNA lentiviralment dirigit al WIPI-1. Clarament, la reducció de la diferenciació de neutròfils amb WIPI-1, com es demostra amb els nivells de proteïna CD11b reduïda i ARNm de CEBPE, tots dos marcadors de bona fe per diferenciar neutròfils de les línies cel·lulars AML (figures 3a-d, panells de primera fila). Curiosament, derrocar el WIPI-2 també es va traduir en una diferenciació de neutròfils deteriorada (figures 3a – d, panells de segona fila). Aquests resultats demostren que la diferenciació de neutròfils depèn de la funció WIPI.

Image

Diferenciació de neutròfils a NB4 WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3, però no a les cèl·lules derrocadores BECN1. ( a ) SHC002, shWIPI-1, shWIPI-2, shPI3KC3 i shBECN1 que expressen les cèl·lules NB4 es van diferenciar durant 4 dies i es va mesurar l'eficàcia de derrocament per qPCR. ( b ) Es va avaluar la diferenciació de neutròfils mitjançant la mesura de l'expressió de superfície CD11b amb l'anàlisi FACS, i es mostra un histograma CD11b representatiu. ( c ) Es mostren gràfics de barres de la intensitat de fluorescència mitjana de tres experiments independents. ( d ) L'expressió d'ARNm de CEBPE es va mesurar per qPCR en SHC002, shWIPI-1, shWIPI-2, shPI3KC3 i shBECN1 que expressaven cèl·lules NB4 en un tractament ATRA 1 μ M després de 4 dies. ( e ) El test NBT es va realitzar el dia 4 en cèl·lules SHC, shWIPI-1, shWIPI-2, shPI3KC3 i shBECN1 NB4 i cèl·lules positives NBT a partir de dos experiments independents realitzats per duplicat. ( f ) L'abundància de transcripció relativa de la WIPI-1 i la WIPI-2 es va calcular tal com es descriu a. 12 MWU, * P <0.05. ** P <0, 01, *** P <0, 001. Test MWU, Mann – Whitney U

Imatge a mida completa

Per abordar més l’inici de l’autofàgia depenent del PI3P durant la diferenciació d’APL, es va investigar si l’orientació de shRNA lliurada de forma lentiva de PI3KC3 o la seva subunitat reguladora Beclin 1 (BECN1) interfereix amb la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA. La derrota de PI3KC3 va provocar una diferenciació dràstica dels neutròfils (figures 3a-d, tercera fila). D’acord amb això, la inhibició de la producció de PI3P utilitzant l’inhibidor de compost petit PI3K LY294002 que inhibeix la formació de WIPI-1 puncta, 13 també va reduir l’abundància de CD11b, marcant la diferenciació NB4 (figura suplementària 2). Tanmateix, la inhibició de Beclin 1 no va afectar la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA, ja que es van trobar nivells similars de CD11b i CEBPE en el control NB4 i de cèl·lules knock-Beclin 1 (figures 3a-d, panells de quarta fila). Això indica que la funció WIPI depenent de PI3P a la iniciació autòfaga és necessària per a la diferenciació de neutròfils de cèl·lules NB4, però que la subunitat reguladora del complex Beclin 1 del complex PI3KC3 pot no estar implicada en la producció de PI3P en aquest tipus de cèl·lules.

És important destacar que també es va comprovar si es destrueixen WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3 o Beclin 1 la funció neutròfila afectada mitjançant un assaig de nitroblue tetrazolium (NBT) que mesura la producció d’espècies reactives d’oxigen (figura 3e). El setanta-dos per cent de les cèl·lules de control transduïdes amb shRNA no orientat van reduir la NBT incolora a dipòsits foscs intracel·lulars després de 96 h de tractament amb ATRA (figura 3e). Només el 39% de les WIPI-1 i el 50% de les cèl·lules derrocadores de l’API WIPI-2 APL van tacar NBT positiu (figura 3e, quantificació a la dreta). De la mateixa manera, la derrota de la funció de neutròfils atenuada de PI3KC3, mentre que la inhibició de Beclin 1 no va influir en la reducció de la NBT en la diferenciació de neutròfils (figura 3e). Aquest resultat subratlla encara més que WIPI-1, WIPI-2 i PI3KC3 però no Beclin 1 participen en la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA i la funció de les cèl·lules de leucèmia mieloide.

A més, la comparació directa dels nivells relatius a la transcripció de WIPI-1 i WIPI-2 va revelar que la WIPI-2 (90-99%) s’expressa més en cèl·lules APL NB4 no diferenciades i diferenciades que WIPI-1 (1-10%), cosa que suggereix que paper de limitació de la taxa de WIPI-1 durant la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA de cèl·lules NB4 (Figura 3f).

Per controlar si les cèl·lules de Beclin 1 són autofàgiques competents, es va mesurar la formació de puntuació LC3 tant en la inanició a curt termini com en el tractament amb ATRA. 22, 23 Com era d’esperar, enderrocar l’autofagia induïda per la fam inhibida de Beclin 1 (figura suplementària 3a, barres negres); tanmateix, la derrota de Beclin 1 no va afectar l’autofàgia induïda per ATRA (figura suplementària 3a, barres blanques). A més, es va utilitzar un mètode bioquímic estàndard per determinar la facturació de proteïnes de llarga vida per autofagia i es va mesurar la proteòlisi de proteïnes marcades amb radiotelevisió en cèl·lules knock-1 de Beclin. 23 La proteòlisi en cèl·lules derrocadores Beclin 1 en condicions basals no va disminuir significativament en el tractament amb bafilomicina A1, mentre que les mostres tractades amb ATRA van mostrar una proteòlisi reduïda significativament al tractament combinat amb bafilomicina A1, cosa que suggereix que l'autofagia basal però no induïda per ATRA requereix Beclin 1. Consistent amb el paper de Beclin 1 en l’autofagia induïda per inanició, les cèl·lules derrocades Beclin 1 no van mostrar una major proteòlisi durant la inanició en comparació amb les cèl·lules de control (figura suplementària 3b), donant suport a una funció per a Beclin 1 en l’autofàgia canònica trobada durant la inanició o durant les condicions basals, però no durant el tractament amb ATRA. És de notar que s’han notificat entrades independents de Beclin 1 al segrest autòfag. 5

Autofagia de WIPI-1- i WIPI-2 depenent de la diferenciació de neutròfils

A continuació, ens vam preguntar si la implicació de les proteïnes efectores PI3P WIPI-1 i WIPI-2 en la diferenciació de neutròfils es pot atribuir, almenys en part, al seu paper en l’autofàgia. Per resoldre aquesta qüestió, es va analitzar el flux autòfag a les cèl·lules derrocadores NB4 WIPI-1 i WIPI-2 mitjançant la Western Blot LC3-II en presència o absència de la bafilomicina A1 de l’inhibidor lisosòmic. Hem trobat quantitats notablement reduïdes de proteïna LC3-II endògena i lipidada després de 4 dies de tractament amb ATRA en combinació amb el tractament amb bafilomicina A1 que indica nivells autòfags reduïts en aquestes cèl·lules derrocades en comparació amb cèl·lules control (Figura 4a). A més, es va expressar l'etiqueta EGCP-Cherry LC3 a la NB4 WIPI-1, així com les cèl·lules derrube WIPI-2. La localització intracel·lular de EGFP-Cherry-LC3 visualitza les membranes autofagosòmiques després de la lipidació LC3. En general, tant en induccions autofàgiques (per exemple, inanició) com en inhibició (per exemple, bafilomicina A1) s’observa un augment de la formació de puntua LC3. Tot i així, utilitzant EGFP-Cherry-LC3, es pot distingir la inducció i la inhibició de l’autofagia. Com que el senyal EGFP és més sensible a les condicions àcides i / o proteolítiques del lumen lisosòmic en comparació amb el senyal de Cherry, un augment del punt de LC3 vermell (EGFP - / Cherry + ) per cèl·lula reflecteix el flux autofàgic actiu i una disminució de la colocalització. Els senyals EGFP + / Cherry + (puntua groga) reflecteixen la inhibició de l’autofagia. Usant shRNAs de control, es va detectar una acumulació de EGFP - / Cherry + LC3 puncta (vermell) el dia 4 del tractament amb ATRA en comparació amb cèl·lules no tractades que indiquen un augment autofàgic. Es va detectar una acumulació de LC3 puncta groc després de bloquejar la degradació autofagosomal (bafilomicina A1, Baf A1) durant el tractament amb ATRA (figura 4b). En canvi, quan el WIPI-1 o el WIPI-2 van ser anul·lats per l’orientació de shRNA lentiviral, l’acumulació de EGFP - / Cherry + LC3 (vermell) punxa al tractament amb ATRA es va atenuar així com d’EGFP + / Cherry + (groc) Formació puntual de LC3 després del co-tractament amb ATRA i bafilomicina A1 (Figura 4b). A més, es va mesurar la facturació de proteïnes de llarga vida a les cèl·lules derrube WIPI-1 i WIPI-2. Vam trobar que la proteòlisi de 14 proteïnes de llarga durada marcades a C va augmentar significativament després de 4 dies de tractament amb ATRA en cèl·lules control NB4 SHC002. Tanmateix, a les cèl·lules derrocadores WIPI-1 i WIPI-2 NB4, no obstant, aquest augment es va abolir significativament (figura 4c i figura suplementària 4a). A més, la inhibició del regulador ascendent amunt WIPI-1 PU.1 va suposar una reducció significativa de les proteïnes de llarga vida (figura 4d i figura suplementària 4b). A mesura que el derrocament PU.1 atenua la diferenciació mediada per ATRA, vam utilitzar cèl·lules NB4-R2 resistents a l’ATRA per comprovar si la disminució de l’autofagia vista a les cèl·lules knock-PU.1 es deu principalment al potencial de diferenciació atenuat d’aquestes cèl·lules. El flux autofàgic determinat per l’abundància de proteïna LC3-II en presència de l’inhibidor lisosòmic de la bafilomicina A1 es va inhibir en cèl·lules NB4-R2 resistents a l’ATRA (figura suplementària 4c). Aquestes dades mostren clarament que la inducció del flux autòfag està associada amb la diferenciació de neutròfils de cèl·lules APL.

Image

La diferenciació atenuada de les cèl·lules APL WIPI-1 i WIPI-2 és deguda en part a una autofagia deteriorada. ( a ) El flux autòfag es va mesurar en SHC002 i shWIPI-1 o shWIPI-2 que expressen cèl·lules NB4 en 1 μ M tractament ATRA el dia 4 en presència o absència de bafilomicina A1 mitjançant la mesura dels nivells endògens de proteïna LC3-II en Western blot i quatre. Es van quantificar els experiments realitzats de forma independent. GAPDH es va utilitzar com a control de càrrega. ( b ) EGFP-Cherry-LC3 que expressa cèl·lules NB4 que es van transduir amb SHC002, shWIPI-1 o shWIPI-2 i les cèl·lules es van tractar amb 1 μ M M ATRA durant 4 dies. Es va afegir Bafilomicina A1 al cap de 3 dies. Es mostren imatges representatives de EGFP-Cherry-LC3 puncta de tres experiments realitzats de manera independent. ( c ) Es va mesurar la taxa de degradació de proteïnes de llarga vida en cèl·lules control i controlades amb ATC SHC002 o amb cèl·lules WIPI-1, WIPI-2, en presència o absència de la bafilomicina inhibidora lisosòmica A1. 21 La taxa de degradació de proteïnes de llarga vida es va calcular com el percentatge de radioactivitat en la fracció soluble en TCA respecte a la radioactivitat total en fraccions no insolubles. A més, es van restar valors de la mostra corresponent tractada amb bafilomicina A1. ( d ) Degradació de proteïnes de llarga durada en el control del NBC SHC002 i de les cèl·lules eliminables PU.1. Anàlisi com al c . MWU, * P <0, 05. ** P <0, 01. Test MWU, Mann – Whitney U

Imatge a mida completa

Per tal de determinar encara més els nivells autòfags durant la diferenciació induïda per ATRA en les cèl·lules knock-Beclin 1, es va realitzar una degradació de proteïnes de llarga durada i els tàndem EGFP-Cherry-LC3 en les respectives cèl·lules del dia 4. La inhibició de Beclin 1 no va disminuir significativament. es va observar proteòlisi de proteïnes de llarga vida i no es van observar diferències per a la formació puntual EGFP-Cherry-LC3 en la derrota de Beclin 1 en comparació amb les cèl·lules control després de 4 dies de tractament amb ATRA (Figuras complementàries 4d i e). D’altra banda, les cèl·lules derrocadores de PI3KC3 NB4 van mostrar una clara tendència ( P = 0.07) cap a una reducció del flux autòfag durant la diferenciació d’APL en comparació amb les cèl·lules de control (figura suplementària 4e). Per excloure que l'augment de la mort cel·lular provoca les diferències en els assajos de flux, es va realitzar una tinció de l'annexina V i el iodur de propidi (PI). Es va observar un augment similar en els nivells de mort cel·lular a Beclin 1, WIPI-1 i PI3KC3 en comparació amb cèl·lules de control (figura suplementària 4f). Així, excloem que les diferències de mort cel·lular entre les diferents cèl·lules autofàgiques són responsables del diferent flux autòfag després del tractament amb ATRA a Beclin 1 enfront de les altres cèl·lules knockdown.

En resum, el bloqueig de WIPI-1 o WIPI-2 i PI3KC3, però no de Beclin 1, deteriora significativament la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA, almenys en part a causa d'una autofagia deteriorada.

Discussió

La desregulació de l’expressió WIPI humana fins ara només es va descriure en una varietat de càncers sòlids, incloent càncer de ronyó, pàncrees, pell, úter i ovari. 11 Afegim ara AML a la llista de càncers amb una expressió WIPI baixa aberrant. Vam trobar que el WIPI-1, però no el WIPI-2 amb l'excepció de l'APL, està regulat significativament en pacients amb LMA en comparació amb neutròfils sans i madurs. Per tant, la disminució dels nivells de WIPI-1 podria contribuir al fenotip mieloide immadur de les explosions d’AML. Com a suport d'aquesta observació, els nivells de WIPI-1 però no de WIPI-2 van ser regulats significativament durant la diferenciació de neutròfils de cèl·lules APL. Tanmateix, la inhibició del WIPI-1 així com del WIPI-2 va deteriorar significativament la diferenciació de neutròfils. Això es pot explicar pels nivells de WIPI-2 relatius molt més alts en comparació amb el WIPI-1 de les cèl·lules APL NB4 que ja són suficients per permetre la diferenciació. Una alta expressió de WIPI-2 en aquestes cel·les pot indicar funcions addicionals de WIPI-2 també en condicions no diferenciadores. A més, els nostres resultats indiquen que la WIPI-1 i la WIPI-2 no són redundants funcionalment durant la diferenciació granulocítica induïda per ATRA, donant suport a l’observació inicial de que tots els membres de la família de la WIPI funcionen com efectors PI3P, però tenen diferents papers en l’autofàgia i el càncer. 11, 25

L’anàlisi de la regulació transcripcional dels gens ATG es troba encara a la seva infància. Diversos estudis van informar que la família p53 de supressors tumorals o factors de transcripció E2F regulen l'expressió de diversos gens ATG. 26, 27 Recentment, es va identificar GATA-1 com el primer factor de transcripció hematopoietica que regula la família LC3 / ATG8 de gens autòfags que medien la clearance mitocondrial durant l'eritropoiesi. 28 Aquí, identifiquem el WIPI-1 com un nou objectiu de PU.1, un factor essencial de transcripció per a la diferenciació de neutròfils que està afectat funcionalment a l’AML. Suport més a la regulació transcripcional de la WIPI-1 mediada per PU.1, Wang et al. 29 es va descriure la unió PU.1 a un lloc 20 kb aigües amunt de l’inici transcripcional WIPI-1 en el transcurs d’una enquesta global de llocs d’unió PU.1 a cèl·lules AML de U937. Com que GATA-1, un agonista PU.1 funcional durant la diferenciació d’eritroides, interacciona amb PU.1, és probable que GATA-1 i PU.1 cooperen en el control de l’expressió del gen ATG a les cèl·lules hemtatopoietiques. 30, 31

Com a dades de Trocoli et al. 19 suggereixen un mecanisme d’autofàgia independent Beclin 1 durant la diferenciació granulocítica induïda per ATRA, ens vam preguntar si l’autofàgia necessària per a la diferenciació granulocítica induïda per ATRA depèn de la generació canònica de PI3P i de les seves proteïnes efectores PI3P. Hem demostrat que les proteïnes efectores PI3P (WIPIs) contribueixen a la diferenciació granulocítica induïda per ATRA. A més, vam demostrar que la inhibició de la WIPI-1 i la WIPI-2 va reduir el flux d’autofàgia durant la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA que suggereix que aquestes proteïnes donen suport a la diferenciació de neutròfils, almenys en part, mitjançant l’activació de l’autofàgia. D'altra banda, la WIPI-1 augmenta després de l'administració ATRA, indicant que la WIPI-1 s'uneix a les membranes autofagògiques tal com es descriu per a l'autofagia canònica 11, 32 i no només augmenta la lipidació LC3, tal com es descriu per l'autofàgia no canònica mediada per resveratrol. 13 Més endavant, vam demostrar anteriorment que l’autofàgia associada a la diferenciació depèn de la formació 21 de puntuació ATG5 21 i ara mostrem que la funció WIPI-1 / WIPI-2 aigües amunt de l’eix ATG5-LC3, tal com descriuen altres persones. 13, 33 Si la WIPI-2 actua aigües amunt de la WIPI-1 o viceversa tal com es descriu, 12 encara està en discussió i s'hauria d'investigar en autofagia induïda per inanició. En conclusió, identifiquem les proteïnes efectores PI3P, WIPI-1 i WIPI-2 com a reguladors positius de la diferenciació de neutròfils en cèl·lules APL.

L’autofàgia canònica es caracteritza principalment per la generació dels complexos Beclin 1 / PI3KC3 i requereix la generació del lípid fosfatidolinositol 3-fosfat (PI3P) senyalitzant 34 (revisat a Burman et al. 35 ). Demostrem clarament que la diferenciació de neutròfils de les cèl·lules APL depèn de PI3P mitjançant farmacològica (LY294002) i inhibició genètica de PI3KC3. Ambdós mètodes d’inhibició de PI3P van donar lloc al mateix fenotip quant a la diferenciació i l’autofàgia, que és coherent amb les dades publicades anteriorment. 36 A més, es subratlla la nostra hipòtesi que PI3P, principalment però no originàriament exclusivament de les cinases PI3 classe III, 37, és crucial per a la diferenciació de neutròfils induïda per ATRA de manera autofagia.

Beclin 1, encara que enzimàticament inert, dóna suport al procés autofàgic regulant la generació de PI3KC3 depenent de PI3P. Curiosament, Beclin 1 no ha deteriorat la diferenciació de neutròfils ni el flux autòfag per al tractament a curt termini, tal com es valora mitjançant la mesura de la LC3 endògena. Sobre la base de les nostres dades addicionals de knockback PI3KC3, WIPI-1 i WIPI-2 que mostren una diferenciació de neutròfils deteriorada per autofagia atenuada, és temptador especular que l’inici de la diferenciació granulocítica induïda per ATRA de les cèl·lules APL segueix una Becon no canònica. Ruta autofagia independent de 1. A més, s'ha informat que l'ATRA, en combinació amb everolimus, podria augmentar la detenció i la diferenciació del creixement en les cèl·lules NB4 i HL60 que il·lustren encara més que l'autofagia contribueix a la diferenciació induïda per ATRA. 38

En resum, les nostres dades donen suport clarament a un paper important de l’autofàgia en la diferenciació d’APL, que depèn de l’eix PI3P-WIPI-1/2-LC3. Per últim, s’ha de tenir en compte la recentment descoberta via PI3P-WIPI-1/2-LC3 operativa en la diferenciació de neutròfils de cèl·lules APL a l’hora de dissenyar estratègies terapèutiques dirigides a l’autofàgia en tractaments contra el càncer.

Material i mètodes

Mostres primàries de pacients

Es va inscriure una cohort de 98 mostres de pacients amb LMA als protocols HOVON / SAKK (Hematologia-Oncologia holandesa-belga / Grup suís per a un grup cooperatiu d’investigació del càncer clínic) -04, -04A, -29 i -42. 39, 40, 41, 42, 43 Tots els pacients van proporcionar el seu consentiment per escrit d’acord amb la Declaració de Hèlsinki. Els aspirants de medul·la òssia o mostres de sang perifèrica es van prendre al diagnòstic. Les explosions i les cèl·lules mononuclears foren purificades mitjançant centrifugació de Ficoll-Hypaque (Nygaard, Oslo, Noruega) i criopreservades. Les mostres d’AML contenien un 80–100% de cèl·lules explosives després del desglaç, independentment del recompte de voladura al diagnòstic. Es van realitzar anàlisis i classificació mutacionals tal com es va descriure anteriorment. 44 Consulteu la taula complementària 1 per a les característiques del pacient.

Línies cel·lulars i condicions de cultiu

Les línies cel·lulars NB4 i la seva subclona 45 NB4-R2 resistent a l'ATRA van ser proporcionades amablement per BETorbett. Les línies cel·lulars es van cultivar en medi RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Buchs, Suïssa) complementat amb un sèrum boví fetal al 10%, 50 U / ml de penicil·lina i 50 μ g / ml estreptomicina en atmosfera humidificada que contenia 5% de CO 2 a 37 ° C. . La diferenciació de cèl·lules NB4 es va induir amb 1 μ M ATRA durant 4 a 6 dies. La diferenciació de neutròfils es va avaluar mitjançant l’anàlisi FACS de la proteïna CD11b o la quantitativa RT-PCR (qPCR) per a l’expressió d’ARNm de CEBPE. El test de reducció de la NBT es va comprovar la diferenciació funcional 46 de la manera següent: es van rentar les cèl·lules amb PBS i es van tractar amb NBT / PMA durant 20 min a 37 ° C, 5% de CO 2 . Després de la incubació, les cèl·lules van ser transferides a diapositives de vidre recobertes per citospina i es van comptabilitzar les cèl·lules positives NBT. Es van anotar almenys 200 cèl·lules per a cada determinació a partir de dos experiments independents realitzats per duplicat. Les dades es van expressar com el percentatge de nombre de cèl·lules positives per NBT respecte al nombre de cel·la viable. La mort de cèl·lules en les cèl·lules transfectades amb SHC002 o shWIPI-1, shPI3KC3 i shBECN1 després del tractament amb ATRA es va avaluar mitjançant la tinció amb annexinV / PI i la citometria de flux. L’aïllament dels neutròfils primaris es va realitzar mitjançant polimorfes (AXIS-SHIELD, Axon Lab, Baden, Suïssa). Les cèl·lules es van col·locar amb cura sobre Polymorphprep i centrifugar durant 40 min a 400 g a temperatura ambient. Es van collir neutròfils primaris i es va aïllar ARN com es descriu a continuació.

Matriu de baixa densitat TaqMan i qRT-PCR en temps real (qPCR)

L'extracció d'ARN, RT-PCR, mesures de matrius de baixa densitat i l'anàlisi de dades es van realitzar tal com es descriu. 47 Assajos d'expressió gènica per a WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3, BECN1 i CEBPE utilitzats en un format de 96 pous en el sistema de detecció de seqüències ABI 7500 van ser Hs00215872_m1, Hs00255379_m1, Hs00176908_m1, Hs00186838_m1, Hs00186838_m1, Hs00186838_m1 Suïssa). S'han descrit prèviament sondes i sondes de HMBS. 48

Assajos autofagis

L’autofagia induïda per ATRA es va bloquejar mitjançant bafilomicina A1 (BML-CM110, Enzo Life Sciences, Lausen, Suïssa) 100 nM o 200 nM. Es va utilitzar LY294002 (L9908, Sigma-Aldrich) a una concentració de 10 μ M. La inanició (EBSS, Sigma-Aldrich (E2888)) es va induir durant 5 h abans de l'anàlisi. El test de degradació de les proteïnes es va realitzar de la següent manera. Les cèl·lules es van tractar amb o sense ATRA i bafilomicina A1 durant 4 dies. Després de 2 dies de tractament amb ATRA, s'ha afegit una valina Ci 14 C-valina (L- (U-14-C)), codi CFB.75, Amersham) per ml / pou. L’afegit de bafilomicina A1 es va realitzar 24 hores abans de l’anàlisi. Al dia 4, es va realitzar el test tal com es descriu a 49. Es van realitzar assajos a curt termini de la següent manera: es van incubar durant 2 dies les cèl·lules amb 0, 3 μ Ci Ci-C Valina per ml / pou. Al dia 2, es va realitzar la prova tal i com es descriu a 49

Western blot

Els extractes de cèl·lules senceres es van preparar mitjançant RIPA o alternativament en tampó de lisi que contenia àcid aminocaproic, Bis-Tris 50 mM, 0, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, complementat amb un còctel inhibidor de proteïneses (complet, Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suïssa). Vuit a 120 μ g de proteïna total es van separar amb un 12% de SDS-poliacrilamida gel i es van transferir a la membrana. Es van incubar els blots amb anticossos primaris en TBS 0, 05% Tween-20/3% BSA durant la nit a 4 ° C, es van rentar i incubar amb anticossos anti-ratolí o anti-conill secundaris acoblats a IRDye durant 1 h a temperatura ambient protegits de la llum. Els anticossos primaris utilitzats van ser anti-LC3B (NB600-1384; Novus Biologicals (LuBioScience), Luzern, Suïssa), antisème anti-WIPI-1 i anti-GAPDH (MAB374; Millipore, Zug, Suïssa). Els anticossos secundaris eren IgG anti-conill (policlonal) anti-rabbit Goat (policlonal) Anti-Rabbit (H + L), (LICOR) (1: 10 000) i Infra-RedDye 800CW (policlonal) L) (LI-COR). Les dades es van analitzar amb l’imaginari infra-vermell de la Odissea LI-COR (Odissea, Bad Homburg, Alemanya).

Anàlisi de superposició de fosfolípids i proteïnes

Àcid amocaproic, 50 mM Bis-Tris, 0, 5 mM EDTA, 1% Triton-X 100 complementat amb còctel inhibidor de proteïna (complet, Roche Diagnostics) complementat amb TBS + 0, 5% Tween en 3% BSA es van utilitzar per sobreposar fosfolípids immobilitzats en membrana. membranes (Echelon Biosciences Inc., Salt Lake City, UT, EUA; P-6001). La detecció de LICOR de la proteïna WIPI-1 lligada amb antisème anti-WIPI-1 es va realitzar tal com es descriu anteriorment.

Test ChIP

Es va realitzar un assaig d'immunoprecipitació per a la cromatina (ChIP) tal com es descriu. 40 regions genòmiques que contenen llocs d’unió PU.1 putatius es van amplificar mitjançant PCR mitjançant els primers imprimadors: lloc A; cap endavant 5′-TGGTTGGGTGCCATGAATGACCA-3 ′ i revers 5′-TGCACAGGGCATTCACAGGGG-3 ′, lloc B; cap endavant 5′-AGCAACCCAATGGGCTTCCCCT-3 ′ i revers 5′-GGAAGGGGGAGGGGCAGGGA-3 ′, lloc C; cap endavant 5′-ACTGGACAGCAATGCCTGAAAACA-3 ′ i revers 5′-TGGCCAGGGTGTGCAGAACAAA-3 ′, lloc D; cap endavant 5′-GCTGCGGATCGGATAGGTCTTGT-3 ′ i revers 5′-TGACGGAGCTGGAAGGTGGGG-3 ′. A més, es va utilitzar com a control negatiu una seqüència no relacionada en el gen GAPDH. 50

Generació de cèl·lules estacionàries estables i cèl·lules que expressen EGFP-Cherry-LC3

Es van comprar a Sigma-Aldrich vectors lentivirals pLKO.1 que expressen petits ARNs (sh) de pinça (sh) dirigits a WIPI-1, WIPI-2, PI3KC3 i BECN1 o a un control de shRNA no orientador (SHCOO2). El doctor MS Soengas va proporcionar un vector lentiviral que expressa EGFP-Cherry-LC3. La producció i transducció lentiviral de cèl·lules NB4 es va fer tal com es descriu. Les 51 cèl·lules EGFP-Cherry-LC3 NB4 amb derrupació WIPI-1, WIPI-2 i BECN1 es van generar per transducció en sèrie amb els dos vectors lentivirals descrits anteriorment. Les poblacions de cèl·lules transduïdes es van seleccionar durant 4 dies mitjançant 1, 5 μ g / ml de puromicina. qPCR es va realitzar per avaluar l'eficàcia de derrocament a les cèl·lules knockdown NB4 WIPI-1, WIPI-2 i BECN1, mentre que western blotting es va utilitzar per demostrar la inhibició de la beclina 1. Per generar cèl·lules induïbles de PU.1, el plasmidi envasat retroviral pCl10A1 i el pBabe-PUER-puro (proporcionats amablement pel doctor H Yoshida) es van coproduir en cèl·lules 293T. El medi de cultiu cel·lular es va eliminar al cap d’un dia i es van incubar les cèl·lules durant 2 min amb PBS / 15% de glicerol. El PBS / 15% glicerol es va substituir per un medi fresc. Les sobrenadants víriques es van collir 48 hores després. Les cèl·lules NB4 es van transduir durant 24 h en presència de 8 μ g / ml polibrè. Es van seleccionar poblacions de cèl·lules NB4 transduïdes amb 1, 5 μ g / ml de puromicina durant 4 dies.

Microscòpia de fluorescència

EGFP-Cherry-LC3 que expressa cèl·lules NB4 es van solucionar amb un 2% de paraformaldehid rentat amb PBS (0, 5% de glicina). Posteriorment, les cèl·lules es van col·locar sobre un vidre amb coberta de poli-L-lisina i es van muntar al mitjà de muntatge fluorescent (S3032; DAKO, Baar, Suïssa). Les imatges es van prendre a un microscopi confocal a la magnificació × 60 per a assaig puntual i a un microscopi de fluorescència per a l’assaig NBT.

Microscòpia d’immunofluorescència

Les cèl·lules es van fixar amb un 2% de paraformaldehid rentat amb PBS (0, 5% de glicina). Posteriorment, les cèl·lules es van col·locar sobre un vidre de coberta recobert de poli-L-lisina permeabilitzat amb tritó. De forma alternativa, les cèl·lules es van fixar amb metanol fred al gel durant 4 min després de la citosfera i després es van rentar amb PBS (0, 5% de glicina). Incubació de l'anticòs anti-WIPI-1 i anti-LC3B durant 1 h a temperatura ambient seguit de tres passos de rentat amb PBS-T. Les cèl·lules es van incubar amb el segon anticòs (111-096-045, Jackson Immuno Research, Suffolk, Regne Unit) durant 1 h a temperatura ambient. El muntatge previ a les cel·les de muntatge amb fluorescència (S3032; DAKO) es va rentar tres vegades amb PBS-T. Les imatges es van prendre en un microscopi confocal a l'ampliació × 60.

Anàlisi estadística

Les proves no paramètriques Mann – Whitney U es van aplicar per comparar la diferència entre dos grups mitjançant el programa GraphPad Prism 4 (Graph Pad Software, San Diego, CA, EUA). Els valors P <0, 05 es van considerar estadísticament significatius.

Informació complementària

Fitxers PDF

  1. 1.

    Informació complementària

Glossari

AML

leucèmia mieloide aguda

APL

leucèmia promielocítica aguda

ATRA

àcid retinoic tot trans

PI3P

fosfatidilinositol 3-fosfat

WIPI

Proteïna que repeteix WD que interacciona amb els fosfositosit

La informació complementària acompanya aquest treball al lloc web de la mort i la malaltia cel·lular (//www.nature.com/cddis)